筛选DUB文库鉴定ATXN3
验证敲低DUB能否调节前列腺癌中YAP蛋白水平。
转染针对每种DUB的siRNA混合物至LnCap细胞，检测YAP蛋白水平。
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ATXN3通过稳定YAP促进前列腺癌进展
ATXN3 promotes prostate cancer progression by stabilizing YAP.
实验完整度
高包含体外细胞系（LnCap/C4-2B）实验、体内异种移植瘤模型及机制验证（蛋白稳定性、泛素化、功能回复实验）
主要模型
LnCap前列腺癌细胞系 C4-2B前列腺癌细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
ATXN3 siRNA序列（siRNA-1: 5'-ACAGGAAGGUUAUUCUAUA-3'; 5'-GGACAGAGUUCACAUCCAU-3'） MG132浓度（10 μM）和处理时间（6小时） CHX浓度（10 μg/mL）处理时间点（0,2,4,6,8小时） 细胞系来源（Procell Life Science&Technology） 体内实验细胞注射数量（1×10^6细胞皮下注射，0.5×10^6细胞尾静脉注射）
摘要
背景：前列腺癌（PC）是最常见的肿瘤，也是全球男性癌症相关死亡的第二大原因。Hippo肿瘤抑制通路在哺乳动物中高度保守，在肿瘤发生中发挥重要作用。YAP是Hippo通路的主要关键效应分子之一。然而，支持PC中YAP异常表达的机制仍有待阐明。方法：使用Western blot检测ATXN3和YAP的蛋白表达，通过实时PCR检测YAP靶基因。CCK8实验检测细胞活力；transwell侵袭实验检测PC的侵袭能力。异种移植瘤模型用于体内研究。蛋白稳定性实验检测YAP蛋白降解。免疫共沉淀实验检测YAP与ATXN3之间的相互作用结构域。基于泛素的免疫共沉淀实验检测YAP上发生的特异性泛素化方式。结果：在本研究中，我们确定了ATXN3，一种去泛素化酶，属于泛素特异性蛋白酶家族，是PC中YAP的真正去泛素化酶。ATXN3被证明以去泛素化活性依赖的方式与YAP相互作用、去泛素化并稳定YAP。ATXN3的缺失降低了PC中YAP蛋白水平以及YAP/TEAD靶基因（包括CTGF、ANKRD1和CYR61）的表达。进一步的机制研究表明，ATXN3的Josephin结构域与YAP的WW结构域相互作用。ATXN3通过抑制YAP蛋白上K48特异性多聚泛素化过程来稳定YAP蛋白。此外，ATXN3缺失显著降低了PC细胞的增殖、侵袭和干样特性。ATXN3缺失引起的效应可通过进一步过表达YAP来挽救。结论：总的来说，我们的发现确立了ATXN3作为YAP去泛素化酶的前所未有的催化作用，并为PC的治疗提供了可能的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ATXN3在YAP稳定性调控中的作用以及其在PC进展中的功能是什么？
- 核心机制
- ATXN3通过其Josephin结构域与YAP的WW结构域相互作用，以去泛素化依赖的方式去除YAP蛋白上的K48多聚泛素化，从而抑制YAP降解，稳定YAP蛋白。
- 主要证据
- 在LnCap和C4-2B细胞中，敲低ATXN3降低YAP蛋白水平，但MG132处理可逆转；ATXN3过表达增加YAP稳定性；体内泛素化实验表明ATXN3去除K48连接的泛素链；YAP过表达可逆转ATXN3敲低的效应。
- 研究意义
- 为前列腺癌的治疗提供可能的靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ATXN3与YAP相互作用验证
确定ATXN3与YAP是否相互作用及其结构域。
免疫荧光共定位、Co-IP、体外pulldown、域缺失突变体Co-IP。
蛋白稳定性及泛素化分析
验证ATXN3是否通过蛋白酶体途径稳定YAP。
CHX处理检测蛋白半衰期、MG132处理检测蛋白酶体依赖、体内泛素化实验检测IP。
去泛素化类型鉴定
确定ATXN3去除哪种类型的泛素链。
在HEK293T细胞中共转染HA-Ub突变体（K6, K11等）和Myc-ATXN3，进行泛素化检测。
体外功能实验
验证ATXN3对PC细胞增殖、侵袭和干性的影响。
CCK8、克隆形成、EdU、transwell侵袭、球形成实验。
体内肿瘤形成实验
验证ATXN3对体内肿瘤生长和转移的影响。
皮下注射C4-2B细胞构建异种移植瘤，尾静脉注射构建肺转移模型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco, Life Technologies | -- | |
| DMEM培养基 | Life Technologies | -- | |
| RNA提取 | Hipure总RNA小提试剂盒 | Magen | -- |
| 逆转录 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green预混液 | Toyobo | -- |
| 7500 Fast实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因试剂盒 | Promega | -- |
| 免疫共沉淀 | RIPA裂解液 | Meilun | -- |
| 去泛素化实验 | MG132 | MCE | -- |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂 | Thermo Scientific | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| YAP抗体 | Proteintech | 66900-1-Ig | |
| ATXN3抗体 | Proteintech | 13505-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| Myc抗体 | Proteintech | 60003-2-Ig | |
| HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 化学发光底物 | Meilun | -- | |
| ChemiDocMP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞增殖分析 | CCK8试剂盒 | Dojindo | -- |
| 克隆形成 | 结晶紫 | -- | -- |
| 细胞侵袭 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 球形成 | 超低吸附培养板 | Corning | -- |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| B27添加剂 | -- | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基、血清浓度、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Methods: Cell culture |
| RNA干扰 | siRNA序列、转染剂量、转染时间 阅读提示：Methods: Plasmids and RNA interference |
| 蛋白稳定性实验 | CHX浓度（10 μg/mL）、处理时间点（0,2,4,6,8小时） 阅读提示：Methods: Protein stability assay |
| 去泛素化实验 | MG132浓度（10 μM）、处理时间（6小时）、质粒转染量和时间（48小时） 阅读提示：Methods: In vivo deubiquitination assay |
| 细胞增殖分析 | 细胞接种密度（2000/孔）、检测时间点（0,24,48,72,96小时）、检测波长（450nm） 阅读提示：Methods: Cell proliferation analysis |
| 细胞侵袭分析 | 细胞数（5×10^5）、上室培养无血清、下室600μl完全培养基、时间（24小时） 阅读提示：Methods: Cell invasion analysis |
| 球形成实验 | 细胞数（2×10^3）、培养基成分（EGF 20ng/ml, B27 1:50, bFGF 20ng/ml）、培养时间（2周） 阅读提示：Methods: Sphere formation assay |
| 体内肿瘤形成 | 细胞数（1×10^6皮下、0.5×10^6尾静脉）、小鼠周龄（6周）、测量频率（每5天） 阅读提示：Methods: In vivo tumorigenesis assay |