组织样本采集与分区
获取乳腺癌患者肿瘤区、界面区和正常区组织，用于后续单细胞分析。
收集3例未经治疗的原发性浸润性乳腺癌患者手术切除的新鲜组织，根据肿瘤边界定义三个区域：肿瘤区、界面区（外边界5mm内）、正常区（外边界至少10mm）。每个区域提取组织用于单细胞悬液制备、免疫荧光和bulk RNA测序。
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单细胞RNA揭示人乳腺肿瘤界面区的致瘤微环境
Single-cell RNA reveals a tumorigenic microenvironment in the interface zone of human breast tumors.
实验完整度
高包含scRNA-seq、bulk-seq、免疫荧光、体外细胞功能实验（增殖、迁移、克隆）及体内小鼠移植瘤模型等多层级验证。
主要模型
人乳腺癌组织（肿瘤区、界面区、正常区） MCF-7细胞系 MCF10A细胞系 BALB/cNj-Foxn1nu/Gpt裸鼠移植瘤模型
重点核对
界面区定义为肿瘤外边界5mm内的组织，正常区为距外边界至少10mm 单细胞RNA测序使用Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kit v3.1，测序平台为Illumina Novaseq 6000 细胞培养条件：MCF-7使用推荐培养基加10% FBS，SKBR3使用RPMI-1640加13% FBS 体内实验：5×10^6细胞皮下注射于裸鼠双侧腹股沟，左侧BMPR1B过表达，右侧对照 统计方法：采用log-rank检验、Pearson相关和双尾配对Student's t检验，定量数据来自三次独立实验
摘要
背景：界面区，即浸润性癌周围的区域，可以被认为是肿瘤微环境的实际组织，具有肿瘤浸润的前驱改变。然而，界面区域微环境的异质性和特征尚未被深入探索。方法：对于体外研究，使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）来表征来自肿瘤区、正常区和界面区的细胞，界面区为肿瘤浸润前沿与正常区之间5毫米宽的带。通过scRNA-seq数据分析，我们比较了不同区域的细胞类型及其转录特征。进行了伪时间、细胞间通讯和通路分析以表征区域特异性微环境。细胞增殖、伤口愈合和克隆形成实验探索了差异表达基因BMPR1B的功能，并通过体内肿瘤模型进行了验证。结果：筛选后，获得并鉴定了88,548个高质量细胞。调节性T细胞、M2巨噬细胞、血管生成相关肥大细胞、DNA修复能力弱的干细胞、具有血管生成活性的内皮细胞、具有胶原合成的成纤维细胞和具有增殖活性的上皮细胞在界面区形成了独特的致瘤微环境。细胞间通讯分析显示，与正常区相比，界面区不同细胞类型之间存在特殊的配体-受体对，保护内皮细胞凋亡并促进上皮细胞增殖和迁移。与正常区相比，高表达的BMPR1B基因促进了界面区癌细胞的致瘤能力。结论：我们的工作确定了界面区独特的致瘤微环境，并加深了对乳腺癌肿瘤微环境的理解，将作为推进乳腺癌诊断和治疗的有用资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 乳腺癌组织界面区的微环境是否具有独特的细胞组成和功能特征，以及特定基因如BMPR1B在界面区中的作用。
- 核心机制
- 界面区存在由调节性T细胞、M2巨噬细胞、促血管生成肥大细胞、DNA修复弱的干细胞、血管生成内皮细胞、胶原合成成纤维细胞和增殖性上皮细胞形成的致瘤微环境；细胞间通讯通过配体受体对保护内皮细胞凋亡并促进上皮细胞增殖迁移；BMPR1B基因高表达促进癌细胞致瘤能力。
- 主要证据
- scRNA-seq分析所有细胞类型和亚群，免疫荧光验证标志物，体外细胞增殖、伤口愈合、克隆形成实验验证BMPR1B功能，体内小鼠移植瘤实验确认BMPR1B促进MCF-7肿瘤生长。
- 研究意义
- 揭示了界面区独特的致瘤微环境，为乳腺癌的诊断和治疗提供新的见解和资源，可能有助于手术切缘的确定。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞RNA文库制备与测序
获得三区域单细胞的转录组数据。
制备单细胞悬液（活细胞比例>85%），使用Chromium Next GEM平台构建scRNA-seq文库，在Illumina Novaseq 6000平台测序。
单细胞数据质量控制和聚类分析
鉴定细胞类型和亚群，比较不同区域的细胞组成和转录特征。
使用Cell Ranger比对基因组，过滤线粒体基因比例<25%和基因数>500的细胞，共获得88,548个细胞。通过Seurat聚类（87个亚群），tSNE可视化，GSVA分析通路活性。
细胞亚群功能分析
分析不同细胞亚群在界面区的功能特征，包括免疫细胞、基质细胞和上皮细胞的促瘤或抑瘤特性。
对T细胞、巨噬细胞、B细胞、干细胞、内皮细胞、成纤维细胞和上皮细胞进行亚群分析，通过marker基因、通路富集、转录因子调控和伪时间分析揭示功能多样性。
细胞间通讯分析
揭示界面区细胞间的相互作用网络，尤其是上皮细胞与基质细胞间的配体-受体对。
使用CellPhoneDB基于配体受体表达预测细胞间相互作用，比较正常区、界面区和肿瘤区的差异。
BMPR1B基因功能验证
验证BMPR1B在界面区上皮细胞中的高表达及其功能。
在MCF10A、MCF-7、SKBR3、MDA-MB-231细胞中稳定过表达BMPR1B，进行RT-qPCR验证、细胞增殖实验（CCK-8）、伤口愈合实验、克隆形成实验，并在裸鼠皮下移植瘤实验验证体内促瘤功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
转录因子调控网络分析
细胞轨迹推断
细胞间通讯分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织处理 | 柠檬酸钠 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 小鼠单克隆抗体抗KRT19 | Proteintech | #60187-1-lg |
| 兔多克隆抗体抗IGFBP5 | Proteintech | #55205-1-AP | |
| 兔多克隆抗体抗DCN | Proteintech | #14667-1-AP | |
| 小鼠单克隆抗体抗MMP11 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58381 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | BI | -- |
| RPMI-1640培养基 | Procell | PM150113 | |
| RT-qPCR | TransZol Up试剂 | TransGen | -- |
| EasyScript®一步法gDNA去除和cDNA合成SuperMix | TransGen | AE311-02 | |
| PerfectStart® Green qPCR SuperMix | TransGen | AQ101-01 | |
| 细胞增殖实验 | 细胞计数试剂盒-8 | TransGene | FC101-01 |
| BioTek Epoch2酶标仪 | BioTek | Epoch2 Instruments |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织样本分区 | 界面区定义（肿瘤外边界5mm内）、正常区定义（外边界至少10mm）、患者纳入标准（原发、高侵袭、非转移）、肿瘤大小限制（<10mm²） 阅读提示：Methods: Patients and tumor specimens |
| 单细胞RNA测序 | 活细胞比例（>85%）、文库制备试剂盒型号、测序平台、过滤参数（线粒体基因<25%，基因数>500） 阅读提示：Methods: Single-cell RNA library preparation and sequencing, Single-cell RNA-seq data processing |
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基、血清浓度（MCF-7等：10% FBS；SKBR3：13% FBS）、细胞传代限制（第5代内使用） 阅读提示：Methods: Cell culture and gene transfection |
| BMPR1B过表达 | 慢病毒载体、感染时间（10小时）、筛选药物（嘌呤霉素）、过表达验证方法（RT-qPCR） 阅读提示：Methods: Cell culture and gene transfection |
| 细胞功能实验 | 细胞增殖（CCK-8孵育3小时，450 nm）；伤口愈合（划痕，1% FBS，观察时间点）；克隆形成（细胞密度1000细胞/孔，观察天数：MCF7第6天，MDA-MB-231第8天，SKBR3第20天） 阅读提示：Methods: Cell proliferation assay, Colony formation assay, Wound-healing assay |
| 体内实验 | 小鼠品系（BALB/cNj-Foxn1nu/Gpt）、细胞注射数量（5×10^6）、注射部位（双侧腹股沟皮下）、对照组（右侧）、取材时间（第15天） 阅读提示：Methods: Tumor-bearing mice |
| 统计分析 | 统计方法（log-rank、Pearson相关、双尾配对t检验）、显著性水平（*p<0.05, **p<0.01）、独立重复次数（3次） 阅读提示：Methods: Statistical analysis |