活性导向分离
从龙葵中分离并鉴定具有抗结直肠癌活性的化合物。
通过柱色谱、半制备HPLC分离得到四个流分E-D1~E-D4，MTT筛选抗CRC活性，进一步分离E-D3得到七个单体化合物，NMR鉴定结构。
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龙葵中的茄碱通过组蛋白去乙酰化酶介导的p53乙酰化通路发挥抗结直肠癌活性
Anti-Colorectal Cancer Activity of Solasonin from Solanum nigrum L. via Histone Deacetylases-Mediated p53 Acetylation Pathway.
实验完整度
高包含体外细胞实验（CCK-8、EdU、流式、Western blot）、体内异种移植模型、IHC及分子对接，涵盖功能验证与机制验证。
主要模型
SW620细胞系 SW480、A549、MGC803细胞系 BALB/c nude小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
SS处理SW620细胞浓度（10-60 μM）及IC50值（35.52 μM） SS处理时间（24 h、48 h）及阳性对照5-FU（0.7 mM） 体内实验分组及剂量：SS（50 mg/kg）、Ent（25 mg/kg）、5-FU（25 mg/kg） 细胞周期检测时间（4 h、24 h）及凋亡检测时间（24 h）
摘要
(1) 背景：龙葵是茄科茄属植物，常用于治疗肿瘤。茄碱是从龙葵中提取的一种甾体生物碱，具有抗结直肠癌活性。(2) 方法：采用柱色谱、半制备高效液相色谱和细胞活性筛选从龙葵中分离潜在的抗结直肠癌活性化合物，并使用1H-NMR和13C-NMR技术进行结构鉴定。在UALCAN数据库中挖掘结直肠癌中HDAC的表达水平。通过Western blot、EdU染色、流式细胞术和免疫荧光检测SS对SW620细胞系的体外作用及其机制。主要采用结直肠癌异种移植模型和IHC染色评价SS在体内的作用。(3) 结果：结果表明，SS是龙葵中抗结直肠癌作用最强的成分，可诱导SW620细胞系凋亡和细胞周期阻滞。HDAC在结直肠癌中高表达。用SS处理SW620细胞系导致HDAC显著下调，P53乙酰化水平升高，随后P21水平升高。体内验证结果表明，SS能有效抑制结直肠癌生长，这与HDAC的下调有关。(4) 结论：SS治疗结直肠癌主要通过诱导凋亡和周期阻滞起作用，其作用机制主要与HDAC诱导的P53乙酰化有关，HDAC/P53信号通路可能是治疗结直肠癌的潜在通路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SS是否具有抗结直肠癌活性，其作用机制是否通过HDAC介导的p53乙酰化通路实现。
- 核心机制
- SS通过抑制HDAC表达，增加p53乙酰化，进而上调p21并下调CDK2，诱导细胞周期S期阻滞和凋亡。
- 主要证据
- 体外SW620细胞实验显示SS抑制增殖、诱导凋亡和S期阻滞，Western blot显示HDAC下调、p53乙酰化增加；体内异种移植模型显示SS抑制肿瘤生长，IHC显示Ki-67降低、凋亡蛋白Caspase3和p53上调；分子对接显示SS与HDAC1/2/3/8结合。
- 研究意义
- 该研究为SS作为HDAC抑制剂治疗结直肠癌提供依据，可能为下一代HDAC抑制剂的设计提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外抗增殖活性检测
评估SS对结直肠癌细胞增殖的抑制作用。
使用CCK-8法检测SS对SW620、SW480、A549和MGC803细胞的活力影响，EdU染色和克隆形成实验验证对SW620增殖的抑制。
细胞周期和凋亡检测
研究SS对SW620细胞周期和凋亡的影响。
流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡率，Western blot检测周期相关蛋白CDK2、p21及凋亡相关蛋白cleave Caspase-3、Bcl2、Cyt C。
数据库分析和机制验证
分析CRC中HDAC表达及生存关系，并验证SS是否通过抑制HDAC影响p53乙酰化。
UALCAN数据库分析COAD中class I HDAC表达和生存，CCK-8检测Ent对SW620活力影响，克隆形成、周期、凋亡实验验证SS与Ent协同作用，Western blot检测HDAC、H3乙酰化、p53乙酰化等。
体内异种移植瘤模型验证
验证SS在体内对结直肠癌生长的抑制作用及其机制。
建立SW620细胞皮下移植瘤模型，分组给药，测量肿瘤体积和重量，IHC检测Ki-67和凋亡蛋白，Western blot检测HDAC、组蛋白乙酰化及周期凋亡相关蛋白。
分子对接
预测SS与class I HDAC的结合能力。
使用Autodock 4.2.6将SS分别与HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8进行分子对接，分析结合能及氢键相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞增殖检测 | EdU试剂盒 | RiboBio | C10310-1 |
| 蛋白质印迹 | ECL化学发光试剂盒 | Beyotime | P0018FM |
| 细胞培养 | 胰蛋白酶 | Solarbio | T1300 |
| 细胞活性检测 | MTT试剂 | Solarbio | M8180 |
| 药物处理 | 二甲基亚砜 | Solarbio | D8371 |
| 蛋白质印迹 | 彩虹180广谱蛋白Marker | Solarbio | PR1910 |
| 细胞培养 | DMEM高糖培养基 | Gibco | SH30243.01 |
| 青霉素-链霉素溶液 | Hyclone | SV30010 | |
| 蛋白质印迹 | PVDF膜 | MERCK | -- |
| 药物处理 | 5-氟尿嘧啶 | MERCK | -- |
| 恩替诺特 | MERCK | -- | |
| 蛋白质印迹 | Bcl2抗体 | Proteintech | 68103-1-Ig |
| Caspase-3抗体 | Proteintech | 66470-2-Ig | |
| 细胞色素C抗体 | Proteintech | 10993-1-AP | |
| p53抗体 | Proteintech | 60283-2-Ig | |
| p21抗体 | Proteintech | 10355-1-AP | |
| CDK2抗体 | Proteintech | 10122-1-AP | |
| HDAC1抗体 | Proteintech | 66085-1-Ig | |
| HDAC2抗体 | Proteintech | 67165-1-Ig | |
| HDAC3抗体 | Proteintech | 67151-1-Ig | |
| HDAC8抗体 | Proteintech | 17548-1 | |
| H4抗体 | Jingjie PTM BioLab | PTM-1009 | |
| H3K18抗体 | Jingjie PTM BioLab | PTM-114 | |
| H3K27抗体 | Jingjie PTM BioLab | PTM-5010 | |
| H3K9抗体 | Jingjie PTM BioLab | PTM-7094 | |
| 植物提取 | D101大孔树脂 | Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute | -- |
| 甲醇 | Energy Chemical | -- | |
| 核磁共振分析 | 氘代甲醇 | Macklin | -- |
| 氘代吡啶 | Macklin | -- | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Hyclon | -- |
| DMEM培养基 | Hyclon | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Speffer | -- |
| 细胞活性检测 | CCK-8试剂盒 | Invigentech | -- |
| EdU检测 | EdU检测试剂盒 | RiboBio | C10310-1 |
| 细胞周期检测 | Flow Jo 7.6.2软件 | -- | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 流式检测 | 流式细胞仪 | Beckman | -- |
| 蛋白质印迹 | 凝胶成像仪 | Apeigen | -- |
| 免疫组化 | 免疫组织化学染色 | Hengjia Bio | -- |
| 分子对接 | ChemDraw 8.0.3软件 | -- | -- |
| Autodock 4.2.6软件 | -- | -- | |
| PyMOL 2.2.0软件 | -- | -- | |
| Discovery Studio Client v19.1.0软件 | -- | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（SW620、SW480、A549、MGC803），培养条件（10% FBS, 1% 青霉素-链霉素, 89% DMEM, 37°C, 5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods, Section 4.3 |
| 药物处理 | SS浓度（10-60 μM），处理时间（24 h），阳性对照5-FU浓度（0.7 mM），溶剂对照DMSO 阅读提示：Results Sections 2.2-2.3, Figure Legends 3-4 |
| 细胞活力检测 | MTT和CCK-8检测的细胞接种密度（8×10^3/孔），药物处理时间（24 h），MTT孵育4 h，CCK-8孵育1 h，检测波长（490 nm和450 nm） 阅读提示：Materials and Methods, Sections 4.5-4.6 |
| 细胞周期和凋亡 | 细胞接种密度（2.5×10^5/孔），药物处理时间（24 h），周期检测使用PI染色，凋亡检测使用Annexin V-FITC/PI双染 阅读提示：Materials and Methods, Sections 4.9-4.10 |
| 蛋白质印迹 | 细胞接种密度（2.5×10^5/孔），药物处理时间（24 h），总蛋白提取方法（2×loading裂解），一抗孵育过夜（4°C），二抗室温1 h 阅读提示：Materials and Methods, Section 4.12 |
| 体内实验 | 动物品系（6周龄SPF雄性BALB/c裸鼠），数量（35只），分组（对照组、5-FU 25 mg/kg、SS 50 mg/kg、Ent 25 mg/kg、SS 50 mg/kg + Ent 25 mg/kg），给药方式（未明确说明，需核对原文），肿瘤体积测量（每7天） 阅读提示：Materials and Methods, Sections 4.4 and 4.13 |
| 免疫组化 | 组织固定（4%多聚甲醛48 h），石蜡包埋，H&E和IHC染色 阅读提示：Materials and Methods, Section 4.14 |
| 分子对接 | 蛋白结构来源（Uniprot/PDB ID：HDAC1 7SME, HDAC2 6WBZ, HDAC3 AF-O15379-F1, HDAC8 AF-Q9BY41-F1），小分子结构来源（PubChem），对接软件和参数 阅读提示：Materials and Methods, Section 4.15 |