临床样本SHMT1表达分析
评估SHMT1表达与RCC分期及患者预后的关系
利用GEPIA2数据库分析258例KIRC患者SHMT1表达与分期和生存的关系；Western blot检测6对RCC及癌旁组织；IHC染色检测13对RCC及癌旁组织。
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HOXD8通过上调SHMT1表达抑制肾细胞癌生长
HOXD8 suppresses renal cell carcinoma growth by upregulating SHMT1 expression.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、体内异种移植瘤模型、临床样本分析及ChIP等机制验证，证据层级多样。
主要模型
OSRC-2和ACHN肾细胞癌细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 BXD小鼠肾组织表达数据集 13例RCC患者肿瘤组织样本
重点核对
SHMT1在RCC组织中的表达水平及与患者预后的相关性 SHMT1过表达对RCC细胞增殖、迁移及细胞周期的影响 SHMT1过表达对裸鼠皮下移植瘤生长的影响 HOXD8对SHMT1表达的调控及其结合位点的验证
摘要
氨基酸合成的增强据报道可促进肿瘤发生。丝氨酸/甘氨酸生物合成途径是由细胞质丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)1和线粒体SHMT2催化的丝氨酸和甘氨酸的可逆转化；然而，SHMT1在肾细胞癌(RCC)中的作用仍不清楚。我们发现SHMT1低表达与RCC患者较差的总生存期相关。体外研究表明，SHMT1过表达抑制了RCC的增殖和迁移。在小鼠肿瘤模型中，SHMT1显著延缓了RCC肿瘤的生长。此外，通过基因网络分析，我们发现了几个SHMT1相关基因，其中同源盒D8 (HOXD8)被确定为SHMT1的调节因子。敲低HOXD8降低了SHMT1的表达，导致RCC生长加快，并挽救了SHMT1过表达诱导的细胞迁移缺陷。此外，ChIP实验发现HOXD8与SHMT1启动子的结合位点位于-456~-254 bp区域。总之，SHMT1在RCC中作为肿瘤抑制因子发挥作用。转录因子HOXD8可以促进SHMT1的表达并抑制RCC细胞的增殖和迁移，这提供了SHMT1在RCC肿瘤生长中的新机制，并可能作为临床治疗的潜在治疗靶点候选。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SHMT1在肾细胞癌中的表达和功能及其上游调控机制尚不清楚，本研究旨在探讨SHMT1在RCC中的作用及其调控因子。
- 核心机制
- 转录因子HOXD8结合SHMT1启动子区域(-456~-254 bp)上调SHMT1表达，SHMT1通过诱导G2/M期阻滞和DNA损伤抑制RCC细胞增殖和迁移。
- 主要证据
- 通过GEPIA2数据库和临床样本分析发现SHMT1低表达与不良预后相关；体外过表达SHMT1抑制RCC细胞增殖和迁移，敲低则促进；小鼠异种移植瘤模型证实SHMT1抑制肿瘤生长；ChIP和荧光素酶报告实验证实HOXD8直接结合并激活SHMT1启动子。
- 研究意义
- 研究揭示了SHMT1在RCC中的肿瘤抑制作用及其调控机制，提示HOXD8-SHMT1轴可能成为RCC治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞功能实验
验证SHMT1对RCC细胞增殖、迁移和细胞周期的影响
在OSRC-2和ACHN细胞中过表达或敲低SHMT1，通过CCK8、Transwell、划痕实验、流式细胞术和Western blot检测细胞增殖、迁移、细胞周期和相关蛋白。
体内异种移植瘤实验
验证SHMT1对RCC肿瘤生长的抑制作用
将稳定过表达SHMT1的OSRC-2细胞皮下注射至裸鼠，测量肿瘤体积和重量，并进行IHC染色检测增殖和凋亡标志物。
BXD小鼠eQTL分析
寻找调控SHMT1表达的上游基因
利用GeneNetwork数据库的BXD小鼠肾组织表达数据，进行eQTL定位和基因关联分析，筛选SHMT1的潜在调控因子。
HOXD8调控SHMT1验证
验证HOXD8能否通过结合SHMT1启动子调控其表达
在OSRC-2和ACHN细胞中过表达或敲低HOXD8，检测SHMT1蛋白水平；通过荧光素酶报告实验和ChIP实验验证HOXD8对SHMT1启动子的结合和激活作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | OSRC-2 | Procell Life Science & Technology | CL-0177 |
| ACHN | Procell Life Science & Technology | CL-0021 | |
| 细胞转染 | JetPRIME转染试剂 | Polyplus | -- |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒-8 | Bimake | B34304 |
| 细胞迁移 | Transwell小室 | Corning | 3244 |
| RNA提取和RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| RT-qPCR | 逆转录酶 | Vazyme | R323-010 |
| SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711-02 | |
| 蛋白质提取 | 细胞裂解液 | Beyotime | P0013 |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 抗SHMT1抗体 | CST | D3B3J | |
| 抗cyclinB抗体 | CST | 4138S | |
| 抗CDC20抗体 | CST | 4823S | |
| 抗β-actin抗体 | GenScript | A00702 | |
| 抗HOXD8抗体 | SantaCruz | sc-515357 | |
| 抗p21抗体 | ABclonal | A1483 | |
| 抗γ-H2AX抗体 | CUSABIO | CSB-PA010097OA139phHU | |
| 抗磷酸化CDK1抗体 | CUSABIO | CSB-PA000492 | |
| 抗磷酸化CHK1抗体 | CUSABIO | CSB-PA006769 | |
| 抗磷酸化CDC25抗体 | CUSABIO | CSB-PA080107 | |
| 抗cyclinE抗体 | SANTA | sc-377100 | |
| 抗cyclinD抗体 | WanleiBio | WL01435a | |
| ECL检测试剂盒 | Wanleibio | -- | |
| 免疫组织化学 | 抗SHMT1抗体（IHC） | CST | 80715 |
| 抗Ki67抗体 | CST | 9449 | |
| 抗cleaved caspase-3抗体 | CST | 9661L | |
| 抗p21抗体（IHC） | Proteintech | 10355-1-AP | |
| 免疫组织化学试剂盒 | Gene Tech | GK600510 | |
| 荧光素酶报告实验 | 荧光素酶报告实验底物试剂盒 | Beyotime | RG005 |
| ChIP | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9003 |
| 质粒构建 | 定点突变试剂盒 | Yeasen | 11003ES10 |
| 凝胶回收试剂盒 | Omega Bio-Tek | -- | |
| Hieff Clone一步克隆试剂盒 | Yeasen | 10911ES08 | |
| DNA损伤检测 | 彗星实验试剂盒 | ELK Biotechnology | CA001 |
| 药物处理 | DS18561882 | MCE | HY-130251 |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 最低必需培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本SHMT1表达分析 | SHMT1表达与RCC分期及生存的关系，样本量259例KIRC患者，6例RCC及癌旁组织（Western blot），13例RCC及癌旁组织（IHC） 阅读提示：见Results 3.1节及Figure 1 |
| 细胞培养与转染 | 细胞系（OSRC-2和ACHN）的来源及培养条件；转染试剂JetPRIME；细胞转染后48-72小时收获 阅读提示：见Materials and Methods 2.2节 |
| 细胞增殖实验（CCK8） | 2000细胞/孔接种于96孔板；CCK8浓度10%，孵育1小时；检测波长450 nm；记录4-5天 阅读提示：见Materials and Methods 2.3节 |
| 细胞迁移实验（Transwell和划痕） | Transwell小室孔径8μm；细胞数5×10^4；孵育24或48小时；划痕实验用200μL枪头划痕，培养48小时 阅读提示：见Materials and Methods 2.4和2.5节 |
| 体内异种移植瘤模型 | BALB/c裸鼠年龄6-8周；细胞注射量1×10^7；肿瘤体积测量频率每2天；处死标准肿瘤体积达1000 mm^3 阅读提示：见Materials and Methods 2.8节 |
| HOXD8调控机制验证 | ChIP结合区域-456~-254 bp；荧光素酶报告实验转染条件（HEK293T细胞2.0×10^5） 阅读提示：见Materials and Methods 2.10-2.11节及Results 3.6节 |