临床样本中CHPF表达与预后分析
检测CHPF在结肠癌组织中的表达水平及其与临床病理特征和预后的相关性
通过GEPIA数据库分析CHPF表达,并在62对结肠癌和癌旁组织中用RT-qPCR和Western blot检测CHPF mRNA和蛋白水平,用Kaplan-Meier分析评估总生存期
MiR-214-3p overexpression-triggered chondroitin polymerizing factor (CHPF) inhibition modulates the ferroptosis and metabolism in colon cancer.
包含临床组织样本、细胞模型和动物模型,并进行了功能验证(增殖、铁死亡、糖酵解)及机制验证(miRNA靶向)。
SW480和SW620结肠癌细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 62对结肠癌及癌旁组织样本
CHPF在结肠癌组织中的表达水平(RT-qPCR、Western blot) SW480和SW620细胞中CHPF敲低效率(shRNA) erastin(5 μM)和Ferrostatin-1(1 μM)处理浓度及时间(12 h) 动物实验中每组小鼠数量(n=5)及接种细胞数(2×10^6) miR-214-3p与CHPF的直接结合(荧光素酶报告基因)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测CHPF在结肠癌组织中的表达水平及其与临床病理特征和预后的相关性
通过GEPIA数据库分析CHPF表达,并在62对结肠癌和癌旁组织中用RT-qPCR和Western blot检测CHPF mRNA和蛋白水平,用Kaplan-Meier分析评估总生存期
验证CHPF敲低对结肠癌细胞增殖、铁死亡和糖酵解的作用
用shRNA敲低SW480和SW620细胞中CHPF表达,检测细胞活力(CCK-8)、亚铁离子、ROS、MDA、SOD、4-HNE、葡萄糖摄取、乳酸产量、ATP水平及糖酵解和铁死亡相关蛋白表达
验证CHPF敲低在体内对结肠癌肿瘤生长的抑制作用
将稳定转染sh-NC或sh-CHPF的SW480细胞皮下接种裸鼠,每周监测肿瘤体积和体重,5周后取出肿瘤称重,进行IHC和Western blot检测
验证miR-214-3p是否直接靶向CHPF并负调控其表达
通过starBase、TargetScan和miRDB预测靶向CHPF的miRNA;用miRNA mimics过表达miR-214-3p和miR-760后检测CHPF表达;构建CHPF 3'UTR野生型和突变型荧光素酶报告载体,共转染后检测荧光素酶活性
验证miR-214-3p通过靶向CHPF调控结肠癌细胞增殖、铁死亡和糖酵解
在SW480细胞中过表达miR-214-3p和/或CHPF,检测细胞活力、亚铁离子、ROS、葡萄糖摄取、乳酸产量和ATP水平
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Procell | PM150210 |
| Ham's F-12K培养基 | Procell | PM150910 | |
| 胎牛血清 | Merck | 12103C | |
| 青霉素/链霉素 | Procell | PB180120 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000008 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0037 |
| 铁离子检测 | 铁离子检测试剂盒 | Abcam | ab83366 |
| ROS检测 | DCFH-DA(活性氧荧光探针) | Beyotime | S0033S |
| 脂质过氧化检测 | 脂质过氧化(MDA)检测试剂盒 | Abcam | ab118970 |
| 氧化应激检测 | 超氧化物歧化酶活性检测试剂盒 | Abcam | ab65354 |
| 脂质过氧化检测 | 脂质过氧化(4-HNE)检测试剂盒 | Abcam | ab238538 |
| 糖酵解检测 | 葡萄糖检测试剂盒 | Sigma | -- |
| 乳酸检测试剂盒 | Biovision | -- | |
| ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0026 | |
| 免疫组化 | 石蜡 | Solarbio | YA0011 |
| 自动切片机 | Beyotime | E0972 | |
| 柠檬酸盐抗原修复液 | Beyotime | P0081 | |
| 牛血清白蛋白 | Beyotime | ST2249 | |
| 荧光素酶检测 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Beyotime | RG027 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| 逆转录 | Bio-Rad iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708890 |
| RT-qPCR | 2× SYBR预混液 | Takara | RR820A |
| Bulge-Loop miRNA RT-qPCR引物 | RiboBio | -- | |
| Western blot | 总蛋白提取试剂盒 | Solarbio | BC3711 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | PC0020 | |
| PVDF膜 | Millipore | HVHP04700 | |
| 脱脂奶粉 | Solarbio | D8340 | |
| BeyoECL Plus化学发光试剂 | Beyotime | P0018S | |
| 抗CHPF抗体 | Abcam | ab224495 | |
| 抗HK2抗体 | Abcam | ab227198 | |
| 抗LDHA抗体 | Abcam | ab130923 | |
| 抗GPX4抗体 | Abcam | ab231174 | |
| 抗SLC7A11抗体 | Abcam | ab216876 | |
| 抗β-actin抗体 | Abcam | ab5694 | |
| 免疫组化 | 抗Ki-67抗体 | Abcam | ab15580 |
| 抗CHPF抗体 | Abcam | ab224495 | |
| HRP标记的二抗 | Abcam | ab6721 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源及培养条件(培养基、血清浓度、抗生素) 阅读提示:Methods 2.3 Cell culture |
| 细胞转染 | 转染试剂、质粒或shRNA序列及转染时间 阅读提示:Methods 2.4 Cell transfection and treatment |
| 铁死亡处理 | erastin浓度(5 μM)和Ferrostatin-1浓度(1 μM)及处理时间(12小时) 阅读提示:Methods 2.4 及 Figure 2 图注 |
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度(1×10^4细胞/孔)、CCK-8孵育时间(2小时) 阅读提示:Methods 2.5 CCK-8 analysis |
| 荧光素酶报告实验 | pGL3-Basic载体浓度(2 μg/mL)及共转染后检测时间(24小时) 阅读提示:Methods 2.12 Luciferase assay |
| 动物实验 | 小鼠品系(BALB/c裸鼠)、周龄(4周)、接种细胞数(2×10^6)、分组及样本量(n=5) 阅读提示:Methods 2.10 Animal experiment |