miR-214-3p过表达触发的软骨素聚合因子(CHPF)抑制调节结肠癌中的铁死亡和代谢

MiR-214-3p overexpression-triggered chondroitin polymerizing factor (CHPF) inhibition modulates the ferroptosis and metabolism in colon cancer.

作者信息Zhi-Yuan Yun, Di Wu, Xin Wang, Peng Huang, Na Li
PMID38190270
发布时间2024-03
DOI10.1002/kjm2.12802

实验完整度

包含临床组织样本、细胞模型和动物模型,并进行了功能验证(增殖、铁死亡、糖酵解)及机制验证(miRNA靶向)。

主要模型

SW480和SW620结肠癌细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 62对结肠癌及癌旁组织样本

重点核对

CHPF在结肠癌组织中的表达水平(RT-qPCR、Western blot) SW480和SW620细胞中CHPF敲低效率(shRNA) erastin(5 μM)和Ferrostatin-1(1 μM)处理浓度及时间(12 h) 动物实验中每组小鼠数量(n=5)及接种细胞数(2×10^6) miR-214-3p与CHPF的直接结合(荧光素酶报告基因)

摘要

结肠癌是一种常见的癌症,全球死亡率高。软骨素聚合因子(CHPF)在多种癌症中的作用已被阐明。然而,其在结肠癌中的作用和机制仍不清楚。通过GEPIA数据库、逆转录定量聚合酶链反应和蛋白质印迹检测CHPF的表达。在结肠癌患者中确定了CHPF表达与临床病理特征及miR-214-3p水平的关系。通过细胞计数试剂盒-8、生化检测、荧光素酶和蛋白质印迹实验评估了CHPF在结肠癌细胞生长、铁死亡和糖酵解中的作用和机制。此外,在异种移植小鼠中探索了CHPF的作用。CHPF表达升高,并与结肠癌患者晚期TNM分期、低分化和较短的总生存期相关。敲低CHPF抑制了结肠癌细胞生长,并在体内外下调了参与铁死亡和糖酵解的蛋白表达。此外,CHPF沉默增加了亚铁和ROS的水平,但降低了葡萄糖摄取、乳酸产物和ATP水平。机制上,miR-214-3p直接靶向CHPF并负调控其表达。miR-214-3p的上调降低了细胞活力、葡萄糖摄取、乳酸产物和ATP水平,但增加了亚铁和ROS的水平,这些效应被CHPF的过表达所逆转。CHPF的上调预示不良预后,miR-214-3p/CHPF轴抑制生长,下调糖酵解相关指标水平,并促进结肠癌细胞铁死亡。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
CHPF在结肠癌中的表达、作用及潜在分子机制尚不清楚
核心机制
miR-214-3p直接靶向CHPF并负调控其表达,从而抑制生长、下调糖酵解指标并促进铁死亡
主要证据
在结肠癌组织和细胞系中CHPF表达上调;敲低CHPF抑制体内外肿瘤生长,增加亚铁离子和ROS水平,降低糖酵解指标;miR-214-3p过表达通过靶向CHPF产生类似效应
研究意义
CHPF可能作为结肠癌诊断和治疗的一个潜在靶点

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

临床样本中CHPF表达与预后分析

检测CHPF在结肠癌组织中的表达水平及其与临床病理特征和预后的相关性

通过GEPIA数据库分析CHPF表达,并在62对结肠癌和癌旁组织中用RT-qPCR和Western blot检测CHPF mRNA和蛋白水平,用Kaplan-Meier分析评估总生存期

2

体外敲低CHPF对结肠癌细胞功能的影响

验证CHPF敲低对结肠癌细胞增殖、铁死亡和糖酵解的作用

用shRNA敲低SW480和SW620细胞中CHPF表达,检测细胞活力(CCK-8)、亚铁离子、ROS、MDA、SOD、4-HNE、葡萄糖摄取、乳酸产量、ATP水平及糖酵解和铁死亡相关蛋白表达

3

体内敲低CHPF对肿瘤生长的影响

验证CHPF敲低在体内对结肠癌肿瘤生长的抑制作用

将稳定转染sh-NC或sh-CHPF的SW480细胞皮下接种裸鼠,每周监测肿瘤体积和体重,5周后取出肿瘤称重,进行IHC和Western blot检测

4

miR-214-3p靶向CHPF的验证

验证miR-214-3p是否直接靶向CHPF并负调控其表达

通过starBase、TargetScan和miRDB预测靶向CHPF的miRNA;用miRNA mimics过表达miR-214-3p和miR-760后检测CHPF表达;构建CHPF 3'UTR野生型和突变型荧光素酶报告载体,共转染后检测荧光素酶活性

5

miR-214-3p/CHPF轴的体外功能验证

验证miR-214-3p通过靶向CHPF调控结肠癌细胞增殖、铁死亡和糖酵解

在SW480细胞中过表达miR-214-3p和/或CHPF,检测细胞活力、亚铁离子、ROS、葡萄糖摄取、乳酸产量和ATP水平

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基ProcellPM150210
Ham's F-12K培养基ProcellPM150910
胎牛血清Merck12103C
青霉素/链霉素ProcellPB180120
Lipofectamine 3000转染试剂InvitrogenL3000008
CCK-8试剂盒BeyotimeC0037
铁离子检测试剂盒Abcamab83366
DCFH-DA(活性氧荧光探针)BeyotimeS0033S
脂质过氧化(MDA)检测试剂盒Abcamab118970
超氧化物歧化酶活性检测试剂盒Abcamab65354
脂质过氧化(4-HNE)检测试剂盒Abcamab238538
葡萄糖检测试剂盒Sigma--
乳酸检测试剂盒Biovision--
ATP检测试剂盒BeyotimeS0026
石蜡SolarbioYA0011
自动切片机BeyotimeE0972
柠檬酸盐抗原修复液BeyotimeP0081
牛血清白蛋白BeyotimeST2249
双荧光素酶报告基因检测试剂盒BeyotimeRG027
TRIzol试剂Thermo Fisher Scientific15596026
Bio-Rad iScript cDNA合成试剂盒Bio-Rad1708890
2× SYBR预混液TakaraRR820A
Bulge-Loop miRNA RT-qPCR引物RiboBio--
总蛋白提取试剂盒SolarbioBC3711
BCA蛋白定量试剂盒SolarbioPC0020
PVDF膜MilliporeHVHP04700
脱脂奶粉SolarbioD8340
BeyoECL Plus化学发光试剂BeyotimeP0018S
抗CHPF抗体Abcamab224495
抗HK2抗体Abcamab227198
抗LDHA抗体Abcamab130923
抗GPX4抗体Abcamab231174
抗SLC7A11抗体Abcamab216876
抗β-actin抗体Abcamab5694
抗Ki-67抗体Abcamab15580
抗CHPF抗体Abcamab224495
HRP标记的二抗Abcamab6721

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
细胞系来源及培养条件(培养基、血清浓度、抗生素)
阅读提示:Methods 2.3 Cell culture
细胞转染
转染试剂、质粒或shRNA序列及转染时间
阅读提示:Methods 2.4 Cell transfection and treatment
铁死亡处理
erastin浓度(5 μM)和Ferrostatin-1浓度(1 μM)及处理时间(12小时)
阅读提示:Methods 2.4 及 Figure 2 图注
细胞活力检测
细胞接种密度(1×10^4细胞/孔)、CCK-8孵育时间(2小时)
阅读提示:Methods 2.5 CCK-8 analysis
荧光素酶报告实验
pGL3-Basic载体浓度(2 μg/mL)及共转染后检测时间(24小时)
阅读提示:Methods 2.12 Luciferase assay
动物实验
小鼠品系(BALB/c裸鼠)、周龄(4周)、接种细胞数(2×10^6)、分组及样本量(n=5)
阅读提示:Methods 2.10 Animal experiment