生物信息学分析
探索GBP1在宫颈癌中的表达、与免疫浸润及预后的关系
整合TCGA和GTEx数据库分析GBP1表达，使用HPA数据库验证蛋白表达，单细胞测序数据分析表达细胞类型；进行PPI、基因相关性、药物敏感性、TME相关性、富集分析。
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GBP1在宫颈癌发生发展中的功能与机制
Function and mechanism of GBP1 in the development and progression of cervical cancer.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验（敲低/过表达、CCK8、Transwell、凋亡检测）、体内动物模型、多色免疫荧光组织验证、RNA-seq可变剪接分析、iRIP-seq及CoIP-MS机制验证，多个独立证据层级。
主要模型
Caski宫颈癌细胞系 雌性裸鼠皮下移植瘤模型 104例宫颈癌组织样本
重点核对
宫颈癌组织芯片（HUteS120Su01）及104例样本的mIF结果 Caski细胞中siRNA敲低和慢病毒过表达的效率（qPCR及Western blot验证） CCK8增殖检测、Transwell侵袭实验和凋亡流式检测的具体条件 体内实验中每组5只裸鼠，皮下注射4×10^6细胞，观察17天 RNA-seq及iRIP-seq、CoIP-MS的样本处理与数据分析方法
摘要
鸟苷酸结合蛋白1（GBP1）是GBP家族中最受关注的成员，具有抗感染和抗血管生成等一系列作用。其在包括宫颈癌在内的恶性肿瘤中的作用仍有争议。我们旨在通过生物信息学和相关实验探讨GBP1对宫颈癌的影响。在本研究中，我们首先发现在多个在线数据库中GBP1普遍表达于宫颈癌，并与免疫浸润密切相关。其次，我们使用多色免疫荧光技术验证了GBP1在宫颈癌组织中的表达及其与免疫浸润的关系，并探讨了其与宫颈癌患者预后的关系。通过体外敲低和过表达GBP1的实验证明GBP1是宫颈癌的潜在癌基因，并通过体内实验验证了其致癌性。为了探讨GBP1促进癌症的潜在机制，对GBP1过表达和敲低表达的细胞系进行了RNA-seq，发现GBP1的敲低和过表达与许多RNA可变剪接事件相关，提示GBP1可能是一种RNA结合蛋白（RBP），通过可变剪接途径影响宫颈癌细胞的生物学特性。然而，随后的RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验证明GBP1不是直接的可变剪接因子，而免疫共沉淀（CoIP）-质谱（MS）实验结合蛋白质相互作用（PPI）分析证明包括异质核核糖核蛋白K（HNRNPK）在内的8个可变剪接因子是GBP1的相互作用蛋白。结合现有报道和RNA-seq可变剪接分析结果，推测GBP1可能通过与相互作用蛋白HNRNPK结合来调节CD44蛋白的可变剪接，从而在宫颈癌中发挥促癌作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GBP1在宫颈癌发生发展中的功能及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- GBP1通过与HNRNPK结合，通过A3SS可变剪接形式调节CD44蛋白的表达，从而促进宫颈癌进展（推测，尚需直接验证）。
- 主要证据
- 体外敲低GBP1抑制Caski细胞增殖和侵袭并促进凋亡，过表达促进增殖和侵袭；体内过表达促进裸鼠移植瘤生长；mIF显示GBP1与PD-L1表达正相关且高GBP1与较差总生存相关；RNA-seq显示GBP1调节CD44的A3SS剪接事件，iRIP-seq显示GBP1非经典RBP，CoIP-MS发现8个剪接因子（包括HNRNPK）为GBP1相互作用蛋白。
- 研究意义
- 本研究首次深入探讨GBP1在宫颈癌中的作用，提出GBP1可能作为宫颈癌新的治疗靶点，并为未来的机制验证提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
多色免疫荧光验证
验证GBP1在宫颈癌组织中的表达及其与免疫标志物PD-1/PD-L1和预后的关系
购买宫颈癌组织芯片，进行mIF染色检测GBP1、CD3、PD-1、PD-L1、CK，并进行生存分析。
体外细胞功能实验
验证GBP1对宫颈癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响
在Caski细胞中通过siRNA敲低和慢病毒过表达GBP1，通过qRT-PCR和Western blot验证效率，通过CCK8、Transwell和流式凋亡检测功能。
体内动物实验
验证GBP1过表达对宫颈癌移植瘤生长的影响
以Caski-OE-NC和Caski-OE-GBP1细胞皮下注射裸鼠，测量肿瘤体积和重量。
RNA-seq及可变剪接分析
探索GBP1调控的可变剪接事件
对GBP1过表达和敲低的Caski细胞进行RNA-seq，鉴定可变剪接事件，并进行富集分析。
iRIP-seq
验证GBP1是否为经典RNA结合蛋白和剪接因子
使用改良的RNA免疫沉淀测序检测GBP1结合的转录本，发现GBP1直接结合的转录本很少，证明其非经典RBP。
CoIP-MS
鉴定与GBP1相互作用的剪接因子
通过CoIP-MS实验鉴定GBP1相互作用蛋白，进行生信分析，发现8个剪接因子。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 多色免疫荧光 | 多克隆兔抗GBP1抗体 | Proteintech | 15303-1-AP |
| qRT-PCR | TRIZOL试剂 | Ambion | 15596-018 |
| Hieff™ qPCR SYBR®Green Master Mix | YEASEN | 11202ES08 | |
| NanoPhotometer N50分光光度计 | IMPLEN | -- | |
| ABI QuantStudio5实时荧光定量PCR仪 | -- | -- | |
| Western blot | 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 |
| 抗GBP1抗体 | ABclonal | A3879 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-IG | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Proteintech | SA00001-1 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00001-2 | |
| 增强化学发光试剂 | Bio-Rad | 170506 | |
| CCK8检测 | 细胞计数试剂盒-8 | MCE | HY-K0301 |
| Transwell侵袭实验 | Transwell小室 | Corning | 3422 |
| 基质胶 | BD Biosciences | 356234 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10091148 | |
| 0.1%结晶紫 | Beyotime | C0121 | |
| 倒置显微镜 | Mshot | MF52-N | |
| 细胞凋亡检测 | Fluor647标记的Annexin V和PI | 4A Biotech | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Procell | PM150210 |
| siRNA转染 | Liopfectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13778150 |
| RNA-seq | KAPA链特异性mRNA测序试剂盒 | KAPA | KK8544 |
| VAHTS mRNA捕获磁珠 | -- | N401-01 | |
| Roche接头 | Roche | KK8726 | |
| smartspec plus分光光度计 | Bio-Rad | -- | |
| iRIP-seq | RNA酶抑制剂 | Takara | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Bimake | -- | |
| Flag抗体 | Sigma | F7425 | |
| IgG抗体 | -- | AC005 | |
| 蛋白A/G Dynabeads磁珠 | Thermo Scientific | -- | |
| 蛋白酶K | Sangon Biotech | -- | |
| KAPA RNA Hyper Prep试剂盒 | KAPA | -- | |
| CoIP-MS | 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 |
| 小鼠IgG | Millipore | 12-371 | |
| 蛋白A/G磁珠 | -- | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | ISEQ00010 | |
| GAPDH抗体 | ATA | ATPA00013Rb |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 多色免疫荧光实验 | 组织芯片来源（上海芯超生物科技有限公司），组织芯片型号HUteS120Su01，GBP1抗体稀释度及孵育时间，各指标染色顺序，光谱扫描仪器型号，104例样本临床数据 阅读提示：Methods中的Multiplex immunofluorescence，Figure legends 7 |
| 细胞培养与转染 | Caski细胞系培养条件（37°C、5% CO2、10% FBS、1%青霉素/链霉素），siRNA序列及转染试剂（RNAiMAX），过表达慢病毒MOI=100，嘌呤霉素筛选浓度未明确说明 阅读提示：Methods中的Cell culture、siRNA transfection、Lentivirus vector infection |
| 体外功能实验 | CCK8检测的细胞数（104个/孔）、复孔数（3个），Transwell实验中细胞数（5×10^5）、Matrigel浓度（1:8）、培养时间（48h），凋亡检测的Annexin V/PI染色步骤，重复次数（每组3/6个复孔） 阅读提示：Methods中的CCK8 assay, transwell invasion assay and cell apoptosis assay，Figure legends 9和10 |
| 动物实验 | 裸鼠品系（雌性、6-8周龄），每组5只，皮下注射细胞数（4×10^6），观察时间（17天），肿瘤体积测量公式，肿瘤重量测量 阅读提示：Methods中的Animal model，Figure legends 11 |
| RNA-seq和剪接分析 | RNA-seq文库制备试剂盒（KAPA），测序平台（Illumina Novaseq6000），比对软件TopHat2，可变剪接分析工具，差异剪接事件的统计显著性阈值（p<0.05） 阅读提示：Methods中的RNA sequencing and alternative splicing analysis，Figure legends 12 |
| iRIP-seq | UV交联剂量（400 mJ/cm2），RNase抑制剂浓度（400 U/mL），DNase I浓度（0.1 U/μl），抗体（Flag和IgG），peak calling方法（ABLIRC和Piranha），统计显著性（p<0.05） 阅读提示：Methods中的Improved RNA immunoprecipitation sequencing (iRIP-seq)，Figure legends 13 |
| CoIP-MS | 抗体（anti-Flag, F1804, 10μg；Mouse IgG, 12-371, 5μg），磁珠用量（20 μl），洗液成分，银染步骤，质谱分析平台，蛋白质鉴定筛选标准 阅读提示：Methods中的Co-immunoprecipitation (CoIP)-mass spectroscopy (MS)，Figure legends 14和15 |