体外抗肿瘤活性评估
评估恩度联合顺铂对NSCLC细胞增殖、迁移和凋亡的影响
使用MTT、集落形成、伤口愈合和流式细胞术检测A549细胞在联合治疗下的活力、增殖、迁移和凋亡变化
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多组学测序揭示恩度联合顺铂通过抗血管生成治疗非小细胞肺癌
Multi-omics sequencing revealed endostar combined with cisplatin treated non small cell lung cancer via anti-angiogenesis.
实验完整度
高包含体外细胞实验（A549、HUVECs共培养）、体内裸鼠移植瘤模型、m6A测序与RNA测序等多层级验证，并进行了功能（METTL3敲低/过表达）和机制验证。
主要模型
A549细胞系 HUVECs BALB/c裸鼠移植瘤模型
重点核对
细胞系：A549（人肺腺癌细胞系） 动物模型：8周龄雄性BALB/c裸鼠，皮下接种A549细胞 给药方案：恩度和顺铂瘤周注射，剂量均为3 mg/kg，联合组6 mg/kg（3+3 mg/kg），每6天一次，共3次 对照组：0.9%无菌氯化钠溶液5 mL/kg，共3次 检测指标：集落形成、迁移、凋亡（流式、TUNEL）、管形成、蛋白和mRNA表达（Western blot、qPCR）
摘要
背景：恩度（Endostar）是一种抗血管生成药物，已被批准用于治疗非小细胞肺癌（NSCLC）。目前，恩度联合放疗或化疗在某些肿瘤的治疗中已取得理想效果，但在NSCLC中的应用和研究缺乏。本研究探讨了恩度联合顺铂（EC）在NSCLC中的治疗效果及潜在机制。方法：采用HE染色、TUNEL染色、免疫荧光、集落形成能力和细胞迁移能力评估EC的抗肿瘤活性。通过western blotting和qPCR检测FMOD、VEGF、FGF-2和PDGF-B的表达。通过m6A测序和RNA测序分析联合治疗的靶点。构建METTL3敲低和过表达的A549细胞，并与HUVECs共培养，以进一步评估METTL3对联合治疗的影响。结果：联合治疗显著降低了NSCLC细胞的集落形成和迁移能力，诱导细胞凋亡，并抑制HUVECs的管形成能力。m6A测序和RNA测序结果显示，EC可下调肿瘤组织中FMOD的表达水平，这可能与其m6A甲基化修饰调节酶METTL3的减少有关。限制FMOD表达可降低FGF2、TGF-β1、VEGF和PDGF-B的表达。此外，METTL3的过表达几乎消除了EC的抗肿瘤作用并促进了血管生成。结论：恩度联合顺铂可能通过下调METTL3和FMOD的表达发挥抗肿瘤作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 恩度联合顺铂在非小细胞肺癌中的抗肿瘤作用及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- 恩度联合顺铂通过下调METTL3表达，降低FMOD的m6A甲基化水平，从而下调FMOD表达，进而抑制肿瘤血管生成。
- 主要证据
- 体外实验显示联合治疗抑制A549细胞增殖、迁移并诱导凋亡；体内实验显示联合治疗抑制肿瘤生长，增加凋亡；m6A和RNA测序显示METTL3和FMOD表达下调，且METTL3过表达逆转联合治疗的效果。
- 研究意义
- 该研究阐明了恩度联合顺铂治疗NSCLC的药理作用和分子机制，支持METTL3和FMOD作为NSCLC的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内抗肿瘤效果评估
验证联合治疗在裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤效果
建立A549细胞皮下移植瘤模型，分组给药后测量肿瘤体积、重量，并进行HE和TUNEL染色
转录组和m6A测序分析
筛选联合治疗后的差异表达基因和差异m6A甲基化基因
提取肿瘤组织RNA，进行RNA测序和m6A测序，分析差异表达基因和差异甲基化基因，并进行联合分析
METTL3功能验证
验证METTL3在联合治疗中的作用
构建METTL3敲低和过表达A549细胞系，与HUVECs共培养，检测细胞活力、迁移、凋亡和管形成能力
体内METTL3功能验证
验证METTL3在体内对联合治疗效果的影响
使用METTL3敲低和过表达的A549细胞构建裸鼠移植瘤模型，给予联合治疗，检测肿瘤生长、凋亡及血管生成相关蛋白表达
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD. | SCXK (Beijing) 2019-0008 |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| Ham's F-12K培养基 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | -- | |
| 免疫组织化学 | 柠檬酸钠缓冲液 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | Gentihold | A1128 | |
| DAB显色液 | -- | -- | |
| qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen Life Technologies | -- |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| 蛋白酶抑制剂 | Solarbio | A8260 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | PC0020 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| FMOD抗体 | Proteintech Group, Inc | 1:1000 | |
| VEGF抗体 | Proteintech Group, Inc | 1:1000 | |
| TGF-β1抗体 | Proteintech Group, Inc | 1:2000 | |
| FGF-2抗体 | Proteintech Group, Inc | 1:1000 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech Group, Inc | 1:1000 | |
| PDGF-B抗体 | Abcam | 1:2000 | |
| TUNEL染色 | 原位凋亡检测试剂盒 | Beijing Sigma Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 细胞转染 | Lipo2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 细胞功能检测 | 结晶紫 | -- | -- |
| 流式细胞术 | FITC标记的Annexin V | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 管形成实验 | 基质胶 | Corning | -- |
| 测序 | NanoDrop s2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| VAHTS Universal V6 RNA-seq文库制备试剂盒 | -- | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | A549细胞使用RPMI 1640+10% FBS+1%青霉素-链霉素；HUVECs使用Ham's F-12K+0.1 mg/mL肝素+0.03-0.05 mg/mL ECGs+10% FBS+1%青霉素-链霉素；培养条件37℃，5% CO2 阅读提示：Methods: Cell and culture conditions |
| 动物模型 | 8周龄雄性BALB/c裸鼠，皮下接种A549肿瘤块（约2 mm3），每组5只；随机分为模型组、恩度组、联合组；给药剂量：恩度和顺铂各3 mg/kg，联合组6 mg/kg，瘤周注射，每6天一次，共3次；模型组给予0.9%氯化钠5 mL/kg 阅读提示：Methods: Nude mouse Tumor xenograft model and drug intervention; Figure legends |
| 药物处理 | 体外实验中，恩度浓度200 μg/mL，顺铂浓度2 μg/mL，处理48小时 阅读提示：Methods: Colony formation test; Results: 图S1 |
| 分子检测 | qPCR引物序列见表1；Western blotting所用抗体及稀释比例：FMOD 1:1000, VEGF 1:1000, TGF-β1 1:2000, FGF-2 1:1000, GAPDH 1:1000, PDGF-B 1:2000 阅读提示：Methods: qPCR, Western blotting; Table 1 |
| 测序分析 | RNA测序和m6A测序使用Illumina NovaSeq 6000平台，PE150；差异表达基因筛选条件|log2FoldChange|≥1, p<0.05；m6A差异峰筛选条件|peak_diff.log2.fc|≥1 阅读提示：Methods: RNA sequencing and m6A sequencing; Results: 转录组分析 |
| METTL3功能验证 | METTL3敲低使用siRNA（3条序列）和过表达载体（pAdTrack-CMV-METTL3）转染A549；共培养体系：A549与HUVECs共培养48小时；管形成实验：HUVECs密度8×10^4细胞/孔，接种后4小时观察 阅读提示：Methods: Adenovirus Infection and transfection, Tube formation capacity assay |