建立心脏肥大模型
通过ISO处理诱导心肌细胞和大鼠心脏肥大，模拟病理状态。
体外使用10 μM ISO处理H9c2和AC16细胞24小时；体内给SD大鼠皮下注射ISO（5 mg/kg/天）连续7天。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
绿原酸通过上调鞘氨醇-1-磷酸受体1抑制内质网应激减轻心脏肥大
Chlorogenic acid attenuates cardiac hypertrophy via up-regulating Sphingosine-1-phosphate receptor1 to inhibit endoplasmic reticulum stress.
实验完整度
高包含体外细胞模型（H9c2、AC16）和体内大鼠模型，涵盖功能验证（细胞大小、凋亡、心脏重量）和机制验证（S1pr1敲低、AMPK/SIRT1通路检测）。
主要模型
H9c2大鼠心肌细胞 AC16人心肌细胞 ISO诱导的心脏肥大SD大鼠模型
重点核对
CGA浓度（0, 10, 50, 100 μM）及处理时间（预孵育2小时） ISO浓度（10 μM）及处理时间（24小时） S1pr1敲低和过表达方法（shRNA和过表达质粒转染） 大鼠ISO剂量（5 mg/kg/天，皮下注射7天）和CGA剂量（90 mg/kg/天，灌胃6天） 统计分析：细胞实验重复3次，动物实验重复5次，使用t检验和ANOVA
摘要
目的：心脏肥大是心脏对应激超负荷的适应性反应，与心力衰竭和心源性猝死密切相关。本研究旨在探讨绿原酸（CGA）对心脏肥大的治疗作用并阐明其潜在机制。方法和结果：为模拟心脏肥大，将心肌细胞暴露于异丙肾上腺素（ISO，10 μM）。同时建立了ISO诱导的大鼠心脏肥大模型。使用定量逆转录PCR和蛋白质印迹法测量心脏肥大标志物、内质网应激（ERS）标志物和凋亡标志物的表达水平。通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记染色、免疫荧光染色、苏木精和伊红染色以及Masson染色测定凋亡水平、心肌细胞大小和心脏组织病理变化。我们发现CGA处理减小了ISO处理的H9c2细胞的体积。此外，CGA以剂量依赖性方式（0、10、50和100 μM）抑制了ISO诱导的心脏肥大标志物（心房钠尿肽、脑钠尿肽和β-肌球蛋白重链）、ERS标志物（C/EBP同源蛋白、葡萄糖调节蛋白78和蛋白激酶R样内质网激酶）和凋亡标志物（bax和cleaved caspase-12/9/3）的上调，但增加了抗凋亡标志物bcl-2的表达。敲低鞘氨醇-1-磷酸受体1（S1pr1）在体外逆转了CGA对心脏肥大、ERS和凋亡的保护作用（P < 0.05）。CGA还恢复了ISO对H9c2细胞中AMP活化蛋白激酶（AMPK）/sirtuin 1（SIRT1）信号传导的抑制，而S1pr1敲低 abolished 了这些CGA诱导的作用（P < 0.05）。CGA（90 mg/kg/天，连续六天）在体内保护大鼠免受心脏肥大（P < 0.05）。结论：CGA处理通过调节S1pr1激活AMPK/SIRT1通路，减轻了ISO诱导的ERS和心脏肥大。关键词：心脏肥大、鞘氨醇-1-磷酸受体1（S1pr1）、绿原酸（CGA）、内质网应激
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 绿原酸（CGA）是否对心脏肥大具有治疗作用，其潜在机制是否涉及S1pr1和AMPK/SIRT1通路？
- 核心机制
- CGA通过上调S1pr1表达，激活AMPK/SIRT1信号通路，从而抑制内质网应激和细胞凋亡，减轻心脏肥大。
- 主要证据
- 在H9c2细胞和大鼠模型中，CGA逆转了ISO诱导的肥大标志物、ERS标志物和凋亡标志物的变化，且S1pr1敲低 abolished 了这些效应。
- 研究意义
- 研究表明CGA可能作为治疗心脏肥大的有效药物，为临床使用CGA缓解心脏肥大提供了新的理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CGA处理细胞和大鼠
评估CGA对心脏肥大的治疗作用及剂量依赖性。
在ISO处理前，用不同浓度CGA（0, 10, 50, 100 μM）预处理H9c2细胞2小时；大鼠灌胃CGA（90 mg/kg/天）6天。
检测心脏肥大标志物
验证CGA对ISO诱导的肥大标志物表达的影响。
通过qRT-PCR和Western blotting检测ANP、BNP、β-MHC的表达，并通过免疫荧光测量细胞大小。
检测内质网应激和凋亡
评估CGA对ISO诱导的ERS和凋亡的抑制作用。
检测ERS标志物（CHOP、GRP78、p-PERK）和凋亡标志物（bax、bcl-2、cleaved caspase-12/9/3）的表达，通过TUNEL染色检测凋亡水平。
S1pr1功能研究
确定S1pr1在CGA保护作用中的必要性。
通过转染shRNA敲低S1pr1，或过表达S1pr1，观察对CGA效应的影响。
检测AMPK/SIRT1通路
验证CGA对AMPK/SIRT1通路的激活作用及S1pr1依赖性。
通过Western blotting检测p-AMPK、AMPK、SIRT1的表达，并检测S1pr1敲低后的影响。
体内验证
在大鼠模型中确认CGA对心脏肥大的保护作用及机制。
测量心脏重量、血压、心脏大小，进行H&E、Masson、TUNEL染色，并检测相关蛋白和mRNA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | ATCC | -- |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| H9c2细胞系 | ATCC | -- | |
| AC16细胞系 | Procell | -- | |
| 药物处理 | 绿原酸 | MCE | HY-N0055 |
| GSK621 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Opti-MEM培养基 | -- | -- | |
| 细胞活性检测 | MTT试剂 | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 细胞形态观察 | Triton X-100 | Absin | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| FITC标记的α-肌动蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 逆转录 | TransScript第一链cDNA合成Super Mix试剂盒 | TransGen Biotech | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green混合液 | Dongshen Biotech | -- |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗体 | 抗ANP抗体 | Abcam | ab225844 |
| Western blotting | 抗BNP抗体 | Abcam | ab19645 |
| 抗β-MHC抗体 | ABclonal | A7564 | |
| 抗S1pr1抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA1-1040 | |
| 抗bax抗体 | Abcam | ab32503 | |
| 抗bcl-2抗体 | Abcam | ab196495 | |
| 抗cleaved caspase-12抗体 | Abcam | ab62484 | |
| 抗cleaved caspase-9抗体 | Cell Signaling Technology | 9507 | |
| 抗cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661S | |
| 抗CHOP抗体 | Cell Signaling Technology | 2895 | |
| 抗GRP78抗体 | Abcam | ab21685 | |
| 抗PERK抗体 | Cell Signaling Technology | 3192S | |
| 抗p-PERK抗体 | Cell Signaling Technology | 3179S | |
| 抗AMPK抗体 | Abcam | ab80039 | |
| 抗p-AMPK抗体 | Abcam | ab131357 | |
| 抗SIRT1抗体 | Abcam | ab110304 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | |
| 动物实验 | SD大鼠 | -- | -- |
| 组织学 | 伊红 | -- | -- |
| TUNEL | TUNEL试剂盒 | Roche | -- |
| 组织学 | 石蜡 | -- | -- |
| 福尔马林 | -- | -- | |
| 数据分析 | Image-Pro Plus 5.1 | Media Cybernetics | -- |
| 显微镜 | 荧光显微镜 | Olympus | -- |
| 光学显微镜 | Nikon | Eclipse TS100 | |
| 统计 | SPSS 19.0 | IBM | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和处理 | H9c2细胞培养条件（DMEM+10% FBS，37°C，5% CO2），ISO浓度10 μM，CGA浓度（0-100 μM）及预处理时间2小时，血清饥饿24小时。 阅读提示：见Materials and methods中的Cell culture部分 |
| 细胞转染 | S1pr1 shRNA或过表达质粒序列，Lipofectamine 3000用量，转染时间48小时。 阅读提示：见Materials and methods中的Cell transfection部分 |
| qRT-PCR | 引物序列（见表1），内参基因GAPDH，使用SYBR Green Mix，2−ΔΔCt法分析。 阅读提示：见Materials and methods中的Quantitative reverse transcription PCR部分及表1 |
| Western blotting | 一抗稀释度（如ANP 1:1000），二抗，ECL检测，GAPDH作为内参。 阅读提示：见Materials and methods中的Western blotting部分 |
| 动物实验 | SD大鼠周龄（5周）、分组（Control, CGA, ISO, ISO+CGA）、ISO给药剂量（5 mg/kg/天皮下注射7天）、CGA给药剂量（90 mg/kg/天灌胃6天）、每组样本量（n=10）。 阅读提示：见Materials and methods中的Animals and treatments部分 |
| 组织学染色 | H&E、Masson、TUNEL染色的具体步骤和试剂，切片厚度（5 μm）。 阅读提示：见Materials and methods中的Haematoxylin and eosin staining, Masson's staining, TUNEL部分 |