CRISPR激活筛选
鉴定与阿帕替尼耐药相关的基因
使用CRISPR/Cas9 SAM文库转导AGS细胞，经阿帕替尼处理两轮后富集耐药细胞，进行sgRNA测序并分析富集基因。
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全基因组CRISPR筛选鉴定ESPL1限制胃癌细胞对阿帕替尼的反应
Genome-wide CRISPR screen identifies ESPL1 limits the response of gastric cancer cells to apatinib.
实验完整度
中包含CRISPR筛选、体外功能验证（增殖、迁移、凋亡）、Co-IP和TCGA数据分析，但缺乏动物模型或患者来源的体内验证。
主要模型
AGS细胞 HGC-27细胞 NCI-N87细胞 BGC823细胞
重点核对
ESPL1过表达或敲低对阿帕替尼敏感性的影响 MDM2 siRNA与阿帕替尼联合处理的效果 p-AKT、VEGF和BCL-2蛋白水平的变化 TCGA数据库中ESPL1与MDM2表达的相关性
摘要
阿帕替尼是首个获批用于治疗转移性胃癌的抗血管生成药物。然而，耐药性的出现是不可避免的。因此，研究阿帕替尼直接作用于癌细胞的新且有价值的脱靶效应具有重要意义。在此，我们通过CRISPR全基因组功能获得性筛选，确定额外纺锤体极样1（ESPL1）是胃癌细胞对阿帕替尼耐药的原因。功能缺失研究进一步表明，抑制ESPL1在体外抑制细胞增殖、迁移并促进凋亡，相应地，ESPL1敲低使胃癌细胞对阿帕替尼增敏。此外，我们发现ESPL1与鼠双微体2（MDM2）相互作用，MDM2是一种E3泛素蛋白连接酶，MDM2 siRNA与阿帕替尼联合使用可协同改善ESPL1过表达诱导的耐药性。总之，我们的研究表明ESPL1在胃癌细胞对阿帕替尼耐药中发挥关键作用。抑制MDM2可恢复胃癌细胞对阿帕替尼的敏感性，并逆转ESPL1介导的耐药。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ESPL1是否参与胃癌细胞对阿帕替尼的耐药，其机制是否涉及MDM2？
- 核心机制
- ESPL1与MDM2相互作用，通过上调p-AKT、VEGF和BCL-2表达促进胃癌细胞对阿帕替尼耐药。
- 主要证据
- CRISPR筛选、体外细胞增殖/迁移/凋亡实验、Western blot、Co-IP和TCGA数据分析表明ESPL1介导耐药且与MDM2相关。
- 研究意义
- 靶向ESPL1可能是克服胃癌阿帕替尼耐药的有效策略，联合MDM2抑制可能改善疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选基因过表达验证
验证候选基因过表达是否介导阿帕替尼耐药
将MCM2、CCND3、ESPL1、PLK1等候选基因的sgRNA激活载体导入AGS和HGC-27细胞，检测增殖、侵袭和凋亡变化。
ESPL1功能抑制实验
验证ESPL1抑制是否增强阿帕替尼敏感性
使用ESPL1 shRNA敲低AGS细胞中ESPL1表达，检测细胞增殖、迁移、凋亡及p-AKT、VEGF、BCL-2蛋白水平。
MDM2相互作用验证
验证ESPL1与MDM2的相互作用及其在耐药中的角色
通过UbiBrowser预测、Co-IP验证ESPL1与MDM2相互作用，并用MDM2 siRNA敲低MDM2观察对ESPL1介导耐药的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
CRISPR筛选
蛋白互作验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | TBD | PS2004HY | |
| 潮霉素B | YEASEN | 60225ES03 | |
| 杀稻瘟菌素 | MDBio | D0120601 | |
| 基因编辑 | CRISPR/Cas9 SAM慢病毒文库 | Addgene | 1,000,000,078 |
| MS2-P65-HSF1 | Addgene | 89,308 | |
| 转染 | Opti-MEM培养基 | Gibco | -- |
| Lipo8000转染试剂 | Beyotime | C0533 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0039 |
| 凋亡检测 | Annexin V-APC | Multisciences | AP104-100 |
| 流式分析 | BD FACS Calibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| Western blot | ESPL1抗体 | Santa Cruz | sc-390314 |
| MDM2抗体 | Santa Cruz | sc-965 | |
| 磷酸化泛AKT1/2/3抗体 | Affbiotech | AF0016 | |
| VEGF抗体 | HUABIO | ET1604-28 | |
| BCL-2抗体 | Proteintech | 12789-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | HRP-60004 | |
| Co-IP | 蛋白A/G磁珠 | GenScript | L00277 |
| RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B | |
| DNA提取 | HiPure组织DNA小提试剂盒 | Magen | -- |
| PCR产物纯化 | QiaQuick试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA-seq | Illumina深度测序 | Novogene Technology | -- |
| Transwell迁移实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | 转导效率、MOI、筛选浓度和时间、测序深度 阅读提示：Methods: Genome-wide CRISPR/Cas9 activation screen |
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基成分、培养条件 阅读提示：Methods: Cell lines |
| 药物处理 | 阿帕替尼浓度、处理时间、溶剂对照 阅读提示：Methods: Cell proliferation assay, Apoptosis assay |
| 功能实验 | 细胞增殖检测方法、迁移实验条件、凋亡检测试剂 阅读提示：Methods: Cell proliferation assay, Migration assay, Apoptosis assay |
| 蛋白检测 | 抗体种属、稀释比例、显色方法 阅读提示：Methods: Western Blot analysis |
| Co-IP | 抗体使用量、孵育时间、洗涤条件 阅读提示：Methods: Co-immunoprecipitation assay |