建立MCAO/R模型并评估神经损伤
建立缺血再灌注模型，验证再灌注阶段细胞死亡激活的时相。
成年雄性C57BL/6小鼠行左侧大脑中动脉闭塞1小时，再灌注2、6、24小时；TTC染色评估梗死体积，五级评分评估神经功能。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
铁在缺血性卒中再灌注早期促进铁死亡和坏死性凋亡
Iron promotes both ferroptosis and necroptosis in the early stage of reperfusion in ischemic stroke.
实验完整度
高包含体内动物模型（MCAO/R）、体外细胞实验、RNA-seq及蛋白互作分析等多层级证据，并进行药物干预功能验证。
主要模型
成年雄性C57BL/6小鼠MCAO/R模型 Neuro-2a小鼠神经母细胞瘤细胞系 L929小鼠成纤维细胞系
重点核对
MCAO/R造模：单侧大脑中动脉闭塞1小时，再灌注2、6、24小时 药物剂量：Lip-1 (10 mg/kg)、Nec-1 (20 mg/kg)、DFO (100 mg/kg)鼻腔给药和腹腔注射，每天一次，共7天，再灌注前加一次 N2a细胞FAS处理浓度：10 μM、100 μM、500 μM、1 mM、5 mM L929细胞经典坏死性凋亡诱导：TNF-α (20 ng/mL)、SM-164 (20 nM)、Z-VAD-fmk (20 μM)
摘要
程序性细胞死亡导致缺血性卒中（尤其是再灌注阶段）的神经损伤。多种细胞死亡途径已在临床前和临床中测试，包括铁死亡、坏死性凋亡和凋亡。然而，缺血/再灌注期间细胞死亡途径的顺序和复杂相互作用仍在研究中。在此，我们通过利用RNA测序分析和免疫印迹分析，无偏地研究了缺血/再灌注期间的细胞死亡途径，并揭示铁死亡和坏死性凋亡在再灌注后早期发生，随后是凋亡。铁死亡抑制剂Liproxstatin-1有效抑制再灌注期间的坏死性凋亡，而坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1抑制了与铁死亡激活一致的蛋白表达。蛋白质-蛋白质相互作用分析和铁螯合剂甲磺酸去铁胺治疗表明，铁能够在大脑中动脉闭塞/再灌注模型小鼠中促进铁死亡和坏死性凋亡。用铁处理细胞导致氧化还原平衡破坏，伴有坏死性凋亡激活和铁死亡易感性增加。总的来说，这些数据揭示了缺血性卒中期间铁死亡和坏死性凋亡之间的复杂相互作用，并表明可以同时靶向多种程序性细胞死亡途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 缺血性卒中再灌注期间，铁死亡、坏死性凋亡和凋亡是否被顺序激活，以及铁是否参与协调这些细胞死亡途径。
- 核心机制
- 缺血性卒中引起铁积累，破坏氧化还原平衡，增强铁死亡易感性并诱导RIPK1磷酸化，从而促进坏死性凋亡，铁同时促进铁死亡和坏死性凋亡。
- 主要证据
- MCAO/R小鼠模型和细胞实验（N2a、L929）中，通过RNA-seq、免疫印迹、流式细胞术及药理学抑制/螯合实验，观察到铁死亡和坏死性凋亡在再灌注早期激活，DFO有效抑制两者。
- 研究意义
- 揭示了缺血性卒中中铁死亡与坏死性凋亡的相互作用，表明靶向过量铁池可能是治疗缺血再灌注损伤的有效策略，为铁螯合剂DFO的临床应用提供新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RNA-seq分析细胞死亡途径
无偏检测再灌注期间差异表达基因和细胞死亡通路富集情况。
提取皮层组织RNA进行RNA-seq，分析差异表达基因，KEGG和GSEA富集分析，关注铁死亡、坏死性凋亡和凋亡通路。
免疫印迹验证细胞死亡标志物时相
验证铁死亡、坏死性凋亡和凋亡蛋白的动态变化。
检测缺血皮层中坏死性凋亡标志物（p-RIPK1、p-RIPK3、p-MLKL）、铁死亡相关蛋白（ACSL4、SLC7a11、GPX4）和凋亡标志物（cleaved caspase-3），并区分可溶和不溶组分。
药物干预验证铁死亡与坏死性凋亡相互作用
明确抑制铁死亡或坏死性凋亡是否影响另一途径。
MCAO/R前7天给予Lip-1（铁死亡抑制剂）或Nec-1（坏死性凋亡抑制剂），再灌注前再次给药；检测梗死体积、神经功能、相关蛋白表达以及氧化应激指标（LPO、MDA、SOD）。
生物信息学分析铁作为链接点
预测铁死亡和坏死性凋亡之间的分子连接。
对RNA-seq数据进行趋势分析和蛋白-蛋白相互作用网络构建，识别涉及铁相关通路的关键基因。
铁螯合剂DFO验证铁的作用
验证铁是否同时调控铁死亡和坏死性凋亡。
MCAO/R前7天给予DFO（铁螯合剂），再灌注前再次给药；评估梗死体积、神经功能、铁死亡和坏死性凋亡标志物以及氧化应激水平。
体外铁处理验证坏死性凋亡易感性
明确铁是否增强细胞对坏死性凋亡的敏感性。
用不同浓度FAS处理N2a和L929细胞，检测细胞活力、铁离子和ROS水平、坏死性凋亡标志物表达；在L929细胞中诱导经典坏死性凋亡（TNF-α/SM-164/Z-VAD-fmk）后观察低剂量FAS的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 利普司他汀-1 | Selleck Chemical | S7699 |
| 坏死他汀-1 | Selleck Chemical | S8037 | |
| 细胞处理 | 坏死他汀-1s | Selleck Chemical | S8641 |
| SM-164 | Selleck Chemical | S7089 | |
| Z-VAD-FMK | Selleck Chemical | S7023 | |
| 药物处理 | 甲磺酸去铁胺 | MedChemExpress | HY-B0988 |
| 细胞处理 | 重组人肿瘤坏死因子-α | Novoprotein Scientific, Inc. | C008 |
| 氧化应激检测 | 丙二醛检测试剂盒 | Abcam | ab233471 |
| 脂质过氧化检测试剂盒 | Jianchen | A106-1-2 | |
| 超氧化物歧化酶检测试剂盒 | Jianchen | A001-3-2 | |
| 动物模型 | 硅胶包被尼龙线栓 | RWD Life Science | -- |
| PeriCam PSI系统 | Perimed | -- | |
| 梗死体积分析 | 氯化三苯基四氮唑 | Sigma | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞活性检测 | MTT细胞毒性检测试剂盒 | Sigma | M2003 |
| 流式分析 | FerroOrange | Dojindo | F374 |
| 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | S0033 | |
| BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher Scientific | D3861 | |
| 流式细胞仪 (LSR Fortessa) | BD | -- | |
| 免疫印迹 | 细胞裂解液 | Beyotime | P0013 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0011 | |
| Nonidet P-40 | -- | -- | |
| 尿素 | -- | -- | |
| Bis-Tris凝胶 | -- | -- | |
| MOPS电泳缓冲液 | -- | -- | |
| Trans-Blot系统 | -- | -- | |
| 增强化学发光 | NCM Biotech | P10300 | |
| ChemiScope 6100 | CLiNX | -- | |
| 抗ACSL4抗体 | Abcam | ab155282 | |
| 抗GPX4抗体 | Abcam | ab125066 | |
| 抗SLC7a11抗体 | Abcam | ab175186 | |
| 抗RIPK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3493S | |
| 抗磷酸化RIPK1抗体 | Cell Signaling Technology | 31122S | |
| 抗RIPK3抗体 | Cell Signaling Technology | 95702S | |
| 抗磷酸化RIPK3抗体 | Cell Signaling Technology | 91702S | |
| 抗MLKL抗体 | Cell Signaling Technology | 37705S | |
| 抗磷酸化MLKL抗体 | Cell Signaling Technology | 37333S | |
| 抗裂解caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664S | |
| 抗小鼠Ig抗体 | Sigma-Aldrich | A9044 | |
| 抗兔Ig抗体 | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| 抗β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | HRP-60004 | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | 15596026 |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | -- | |
| RNA 6000 Nano LabChip试剂盒 | Agilent | -- | |
| mRNA测序样本制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| Illumina Novaseq 6000平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MCAO/R模型建立 | 线栓插入长度（9-10 mm）、缺血时间（1小时）、再灌注时间点（2、6、24小时）、排除标准（激光散斑信号>30%基线） 阅读提示：Methods: Cerebral ischemia-reperfusion model |
| 药物处理 | Lip-1 (10 mg/kg)、Nec-1 (20 mg/kg)、DFO (100 mg/kg)的给药方式（鼻腔滴注+腹腔注射）和给药方案（每天一次，共7天，再灌注前加一次） 阅读提示：Methods: Drug treatment |
| 蛋白表达检测 | 可溶/不溶组分分离方法、抗体稀释度、内参（β-actin或GAPDH） 阅读提示：Methods: Immunoblotting |
| 体外铁处理 | FAS浓度（N2a: 10、100、500 μM；L929: 1、5 mM）、处理时间（24小时或3小时）、诱导坏死性凋亡的试剂浓度（TNF-α 20 ng/mL, SM-164 20 nM, Z-VAD-fmk 20 μM） 阅读提示：Methods: Cell culture and viability assays; Results: Iron effectively increases the susceptibility to necroptosis in vitro |
| 氧化应激检测 | LPO、MDA、SOD检测试剂盒和检测时间点（再灌注6小时） 阅读提示：Methods: Reagents and assay kits; Results: Interactions between ferroptosis and necroptosis during reperfusion |