顺铂诱导KGN细胞凋亡及FTO/YAP1表达变化
观察顺铂对KGN细胞凋亡的影响及FTO和Hippo/YAP通路蛋白的表达变化。
用不同浓度顺铂（0、1、5、10 μM）处理KGN细胞，通过流式细胞术检测凋亡率，Western blot检测FTO、BAX、Bcl-2、cleaved-caspase3、MST1、LATS1、YAP1及磷酸化水平，免疫荧光检测YAP1表达和定位。
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FTO通过调节Hippo/YAP1信号通路减轻顺铂在KGN颗粒细胞样肿瘤细胞中的细胞毒性
FTO attenuates the cytotoxicity of cisplatin in KGN granulosa cell-like tumour cells by regulating the Hippo/YAP1 signalling pathway.
实验完整度
高包含体外细胞模型（KGN细胞系），通过过表达、敲低、药物抑制剂干预，结合流式、Western blot、qRT-PCR、免疫荧光、CCK-8等多层级验证。
主要模型
KGN细胞系（人卵巢颗粒细胞系） 顺铂诱导损伤的KGN细胞模型
重点核对
KGN细胞培养条件：DMEM/F12+10%FBS，37°C，5% CO2 顺铂处理浓度：0、1、5、10 μM FTO过表达载体：pCAG-FTO(human)-3×FLAG，转染剂量：3.0 μg FTO敲低siRNA：50 nM，转染试剂：Lipofectamine 2000 VP处理：浓度未明确说明（文中未明确说明）
摘要
卵巢早衰（POF）是40岁以下女性的一种毁灭性疾病。化疗，尤其是使用顺铂，已被证明可促进原始卵泡和次级卵泡中颗粒细胞的凋亡，导致POF。我们先前的研究表明，脂肪量和肥胖相关（FTO）基因在保护颗粒细胞免受顺铂诱导的细胞毒性中发挥重要作用。多项研究表明，Hippo/YAP信号通路在调节细胞凋亡和增殖中发挥重要作用。此外，YAP1是Hippo信号通路的主要下游靶标，受Hippo信号通路的负调控。然而，Hippo/YAP信号通路是否参与FTO对颗粒细胞的保护作用尚未确定。在本研究中，我们发现顺铂处理后，颗粒细胞凋亡呈浓度依赖性增加，同时FTO和YAP1表达下调。此外，FTO过表达降低了顺铂诱导的颗粒细胞凋亡，抑制了Hippo/YAP激酶级联诱导的YAP1磷酸化，并促进了YAP1进入细胞核。YAP1的下游靶标（CTGF、CYR61和ANKRD1）也增加。siRNA介导的FTO下调促进了顺铂诱导的颗粒细胞凋亡，激活了Hippo/YAP激酶级联，并抑制了YAP1进入细胞核。这些效应被YAP1小分子抑制剂verteporfin（VP）完全逆转。综上所述，这些数据表明，FTO-YAP1在调节顺铂诱导的受损颗粒细胞增殖中发挥积极作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Hippo/YAP1信号通路是否参与FTO对顺铂诱导的颗粒细胞损伤的保护作用？
- 核心机制
- FTO通过抑制Hippo/YAP激酶级联的磷酸化，促进YAP1核转位，进而上调其下游靶基因CTGF、CYR61和ANKRD1的表达，从而抑制颗粒细胞凋亡并促进增殖。
- 主要证据
- 在顺铂处理的KGN细胞中，FTO过表达降低凋亡蛋白BAX和cleaved-caspase3表达，升高抗凋亡蛋白Bcl-2，增加YAP1表达和核定位，下调p-YAP1/YAP1比值；而FTO敲低则产生相反效应，且YAP1抑制剂VP可逆转FTO的保护作用。
- 研究意义
- 该研究首次证明FTO/YAP1轴在调控顺铂诱导的KGN细胞增殖和凋亡中发挥重要作用，为减轻顺铂生殖毒性、防治卵巢早衰提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FTO过表达对KGN细胞凋亡和Hippo/YAP通路的影响
验证FTO过表达是否能抑制KGN细胞凋亡并调节Hippo/YAP信号通路。
将FTO过表达质粒（pCAG-FTO(human)-3×FLAG）转染KGN细胞，以空载体为阴性对照，通过Western blot检测凋亡相关蛋白和Hippo/YAP通路蛋白，qRT-PCR检测下游靶基因mRNA水平，免疫荧光检测YAP1核定位。
FTO敲低对KGN细胞凋亡和Hippo/YAP通路的影响
验证FTO敲低是否能促进KGN细胞凋亡并激活Hippo/YAP信号通路。
将FTO siRNA转染KGN细胞，通过Western blot检测凋亡相关蛋白和Hippo/YAP通路蛋白，qRT-PCR检测下游靶基因mRNA水平，免疫荧光检测YAP1核定位。
VP对FTO保护作用的影响
验证YAP1抑制剂VP是否能逆转FTO对顺铂诱导损伤的KGN细胞的保护作用。
在顺铂诱导损伤的KGN细胞中，过表达FTO并给予VP处理，通过CCK-8检测细胞活力，流式细胞术检测凋亡，Western blot检测凋亡和Hippo/YAP通路蛋白，免疫荧光检测YAP1核定位。
VP对FTO敲低效应的增强作用
验证YAP1抑制剂VP是否能增强FTO敲低对顺铂诱导损伤的KGN细胞的促凋亡作用。
在顺铂诱导损伤的KGN细胞中，敲低FTO并给予VP处理，通过CCK-8检测细胞活力，流式细胞术检测凋亡，Western blot检测凋亡和Hippo/YAP通路蛋白，免疫荧光检测YAP1核定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Sijiqing | -- | |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 药物处理 | 顺铂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 转染 | FTO质粒 | Miaoling | -- |
| 小干扰RNA | RiboBio | -- | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 药物处理 | verteporfin | MedChemExpress | -- |
| Western blot | 抗FTO抗体 | Abcam | ab126205 |
| 抗MST1抗体 | Proteintech | 22245-1-AP | |
| 抗磷酸化MST1 (Thr183)/MST2 (Thr180)抗体 | CST | 49332 | |
| 抗LATS1抗体 | Proteintech | 17049-1-AP | |
| 抗磷酸化LATS1 (Ser909)抗体 | CST | 9157 | |
| 抗YAP1 (D8H1X)抗体 | CST | 14074 | |
| 抗磷酸化YAP (Ser127) (D9W2I)抗体 | CST | 13008 | |
| 抗BAX抗体 | Proteintech | 50599-2-Ig | |
| 抗Bcl-2抗体 | Proteintech | 12789-1-AP | |
| 抗PCNA抗体 | Proteintech | 10205-2-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 66099-1-Ig | |
| 抗cleaved-caspase 3抗体 | CST | 9661S | |
| 细胞凋亡检测 | 膜联蛋白V-PE/7-AAD | BD Biosciences | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| ECL化学发光试剂盒 | Millipore | -- | |
| RNA提取与qRT-PCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| qRT-PCR | SYBR Premix ExTaq™ | Takara | -- |
| StepOne实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| 酶标仪（型号550） | Bio-Rad | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Beyotime | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 抗YAP1抗体 | Proteintech | -- | |
| Alexa Fluo488 | Invitrogen | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪 | Benton Dickinson | -- |
| 免疫荧光 | 荧光显微镜 | Olympus | -- |
| 数据分析 | GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 培养基：DMEM/F12+10%FBS；温度：37°C；CO2浓度：5%；传代频率：每两天；接种密度：2×10^5/孔（6孔板） 阅读提示：Materials and methods, 'The KGN cells culture and treatment' |
| 顺铂处理 | 顺铂浓度：0, 1, 5, 10 μM；溶剂：0.9%盐水；储存：4°C避光 阅读提示：Materials and methods, 'The KGN cells culture and treatment' |
| FTO过表达 | 质粒：pCAG-FTO(human)-3×FLAG；用量：3.0 μg/孔；转染试剂：Lipofectamine 2000 3 μL/孔；细胞融合度：60-80% 阅读提示：Materials and methods, 'FTO protein overexpression and knockdown' |
| FTO敲低 | siRNA浓度：50 nM；转染试剂：Lipofectamine 2000 3 μL/孔；siRNA序列需验证 阅读提示：Materials and methods, 'FTO protein overexpression and knockdown' |
| 凋亡检测 | Annexin V-PE/7-AAD染色；离心1000 rpm/min 5 min；冰PBS洗两次；孵育15 min（室温避光）；上机检测 阅读提示：Materials and methods, 'Flow cytometry assay for cell apoptosis' |
| Western blot | 蛋白上样量：30 μg；SDS-PAGE胶浓度：10%；封闭液：5%脱脂牛奶；一抗4°C孵育过夜；二抗室温1 h；ECL显色 阅读提示：Materials and methods, 'Western blotting analysis' |
| qRT-PCR | RNA提取：Trizol；逆转录；SYBR Premix ExTaq™；StepOne系统；2^-ΔΔCt法；引物序列见原文 阅读提示：Materials and methods, 'RNA extraction and qRT-PCR assay' |
| 细胞增殖检测 | 细胞数：1×10^4/孔（96孔板）；CCK-8试剂：10 μL/孔；孵育：37°C，2 h；检测波长：450 nm 阅读提示：Materials and methods, 'Cell proliferation assay' |
| 免疫荧光 | 固定：4%多聚甲醛 0.5 h；透化：0.5% Triton X-100 0.5 h；封闭：5% BSA 1 h；一抗孵育：4°C过夜；二抗：Alexa Fluo488 1 h；DAPI 0.5 h 阅读提示：Materials and methods, 'Immunofluorescence assay' |
| 统计分析 | 重复次数≥3；数据以mean±SEM表示；t检验或单因素方差分析+Tukey检验 阅读提示：Materials and methods, 'Statistical analysis' |