组织采样与细胞培养
获取PPCs和FPCs用于后续质膜蛋白分析。
从2岁雄性梅花鹿屠宰后无菌收集柄骨膜（PP）和面部骨膜（FP），建立细胞系。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
基于无标记LC-MS/MS的鹿茸干细胞质膜蛋白质组学分析
Proteomic Analysis of Plasma Membrane Proteins of Antler Stem Cells Using Label-Free LC⁻MS/MS.
实验完整度
中包含质膜蛋白提取、LC-MS/MS鉴定、GO/KEGG分析、Western blot和免疫荧光验证，但缺乏功能实验和机制验证。
主要模型
鹿茸柄骨膜细胞（PPCs） 鹿面部骨膜细胞（FPCs）
重点核对
使用MinuteTM质膜蛋白分离试剂盒提取质膜蛋白，经梯度离心分离。 LC-MS/MS鉴定，MaxQuant软件分析，显著差异标准为Fold change >1.5且p<0.05。 细胞培养于DMEM（含10%FBS、链霉素、青霉素），37°C、5%CO2。 Western blot验证五种DEPs（Galectin1、CD9、ITGA3、SPARC、RXFP2）。 免疫荧光验证CD9、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166等干细胞表面标志物。
摘要
鹿茸是一种不寻常的哺乳动物器官，在每年脱落后可以完全再生。柄骨膜中的驻留干细胞（PPCs）为鹿茸再生提供主要细胞来源。质膜蛋白在各种细胞过程中发挥核心作用，但这些蛋白在鹿茸再生中的表达尚未得到充分记录。在本研究中，使用无标记液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）分析了PPCs和面部骨膜细胞（FPCs）的质膜蛋白。共鉴定出1739种蛋白质。其中，53种仅在PPCs中发现，100种仅在FPCs中发现，1576种在PPCs和FPCs中共同存在；39种在PPCs中显著上调，49种在FPCs中上调。从差异表达蛋白（DEPs）中显著富集了总共226个基因本体（GO）术语。这些GO术语的五个生物学过程簇包括对外部刺激的反应、信号转导、膜运输、组织再生的调节和蛋白质修饰过程。需要进一步研究来证明这些DEPs在鹿茸干细胞生物学和鹿茸再生中的相关性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鹿茸柄骨膜干细胞（PPCs）与面部骨膜细胞（FPCs）之间的质膜蛋白组成有何差异，以及这些差异如何参与鹿茸再生？
- 核心机制
- ECM-受体相互作用、PI3K/AKT和VEGF等信号通路可能参与调控鹿茸再生；TIMP2下调与ALCAM表达可能通过ECM-受体相互作用通路发挥作用。
- 主要证据
- 无标记LC-MS/MS鉴定出241个DEPs，包括53个仅存在于PPCs、39个上调；GO分析富集出信号转导、膜运输等生物过程；Western blot验证了Galectin1、CD9、ITGA3等表达差异。
- 研究意义
- 该研究首次分析了鹿茸干细胞的质膜蛋白质组，为理解鹿茸再生的分子机制提供了基础，并确认了PPCs具有干细胞特征。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
质膜蛋白提取
富集质膜蛋白以进行蛋白质组学分析。
使用MinuteTM质膜蛋白分离试剂盒，通过超声裂解和梯度离心分离质膜蛋白。
LC-MS/MS鉴定与定量
鉴定并定量PPCs和FPCs中的质膜蛋白。
蛋白经胰蛋白酶消化，肽段经HPLC分离，Q Exactive Orbitrap质谱仪分析，MaxQuant软件进行蛋白鉴定和定量。
生物信息学分析
分析DEPs的功能和通路富集情况。
使用DAVID 6.7进行GO注释和富集，PANTHER分析分子特征，Enrichment Map插件进行GO聚类，String进行蛋白互作网络分析，KEGG通路富集。
免疫荧光验证
验证干细胞表面标志物的表达。
对PPCs进行免疫荧光染色，检测CD9、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166。
Western blot验证
验证DEPs的表达水平。
分离质膜蛋白，SDS-PAGE电泳，转膜后免疫印迹检测Galectin1、CD9、ITGA3、SPARC、RXFP2。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
质膜蛋白分离
蛋白质组学鉴定与定量
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 质膜蛋白提取 | Minute质膜蛋白分离试剂盒 | Invent biotechnologies | -- |
| 蛋白消化 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 蛋白定量 | MicroBCA蛋白定量试剂盒 | Thermo | -- |
| LC-MS/MS | UltiMate 3000 RSLCnano高效液相色谱系统 | Thermo | -- |
| Q Exactive Orbitrap质谱仪 | Thermo | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| 化学发光检测试剂 | Thermo | -- | |
| HRP偶联山羊抗兔IgG | Beyotime | A0208 | |
| HRP偶联山羊抗小鼠IgG | Beyotime | A0216 | |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| 山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | 150113 | |
| 兔IgG同型对照 | Abcam | ab172730 | |
| 小鼠IgG同型对照 | Abcam | ab37355 | |
| Western blot | CD9抗体 | LSBio | LS-C46004 |
| 免疫荧光 | CD29抗体 | Proteintech | 12594-1 |
| CD44抗体 | Proteintech | 15675-1 | |
| CD73抗体 | Santa | sc-25603 | |
| CD90抗体 | Bioss | bs-0778R | |
| CD105抗体 | Elabscience | ESH135 | |
| CD166抗体 | Bioss | bs-1251R | |
| Western blot | SPARC抗体 | Proteintech | 15274-1 |
| ITGA3抗体 | Bioss | bs-6328R | |
| ATP1B2抗体 | Bioss | bs-23414R |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织采样与细胞培养 | 组织来源：2岁雄性梅花鹿；细胞培养条件：DMEM+10%FBS，37°C、5%CO2；生物学重复数：3。 阅读提示：详见Materials and Methods 4.1 |
| 质膜蛋白提取 | 试剂盒品牌（Invent biotechnologies）；细胞数量（约3×10^6）；离心条件（16000g等）。 阅读提示：详见Materials and Methods 4.2 |
| LC-MS/MS | 蛋白量（100μg）；酶（trypsin）；色谱柱型号；质谱仪参数（分辨率等）；MaxQuant参数（FDR≤0.01等）。 阅读提示：详见Materials and Methods 4.3及表3 |
| Western blot | 上样量（20μg/泳道）；抗体稀释比例；内参（ATP1B2）。 阅读提示：详见Materials and Methods 4.5及表4 |
| 免疫荧光 | 固定条件（4%甲醛20分钟）；封闭液（5%正常山羊血清）；一抗和二抗稀释比例；核染色（DAPI）。 阅读提示：详见Materials and Methods 4.6及表4 |