单细胞转录组图谱构建与转移相关亚群鉴定
构建原发性和转移性骨肉瘤的单细胞转录组图谱，并鉴定与转移相关的细胞群体。
整合 GSE152048 和 GSE234187 的 scRNA-seq 数据，经过质控获得 96,001 个高质量细胞，聚类注释出十种主要细胞类型，通过 inferCNV 鉴定恶性细胞，比较原发和转移样本中细胞比例差异，发现成骨细胞在转移样本中富集。
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S100A13被SP1转录激活促进骨肉瘤转移
S100A13 transcriptionally activated by SP1 facilitates osteosarcoma metastasis.
实验完整度
中包含临床样本表达验证、细胞功能实验和转录调控机制验证，但缺乏体内实验，且机制验证仅依赖荧光素酶报告实验，未进行 ChIP 验证。
主要模型
骨肉瘤细胞系 HOS 骨肉瘤细胞系 MG63 骨肉瘤细胞系 U2OS 143B SAOS2 成骨细胞系 hFOB 1.19
重点核对
细胞系：HOS、MG63、SAOS2、U2OS、143B、hFOB 1.19 转染试剂：Lipofectamine 2000 划痕实验时间：0小时和24小时 Transwell侵袭实验浓度和时间：5×10^5 cells/mL，100μL，48小时 荧光素酶报告实验共转染比例：10:1
摘要
背景：骨肉瘤是一种高度侵袭性的原发性骨恶性肿瘤，远处转移是决定患者预后的关键因素。然而，转移的分子驱动因素仍未完全阐明，因此阐明这些驱动因素成为研究重点。方法：我们整合了单细胞和 bulk RNA 测序数据，以识别与转移相关的细胞群体并筛选候选治疗靶点。生物信息学工具预测了上游转录调控因子。通过伤口愈合、Transwell 和荧光素酶报告基因实验评估了功能作用和转录调控。结果：骨肉瘤异质性的单细胞分析确定了成骨细胞亚群 C2_OB 是转移的主要贡献者。cNMF 分析定义了一个在 C2_OB 中高活性的转移相关表达程序（模块 2），其中 S100A13 被鉴定为一个新的特征基因。S100A13 在骨肉瘤中过表达，并与转移和不良预后相关。功能实验表明，S100A13 促进细胞迁移和侵袭。机制上，转录因子 SP1 直接结合 S100A13 启动子，激活其转录，从而增强骨肉瘤细胞的转移能力。结论：本研究确定 S100A13 是骨肉瘤转移和不良预后的生物标志物，并描述了驱动转移进展的 SP1/S100A13 轴。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 骨肉瘤转移的分子驱动因素是什么？
- 核心机制
- SP1 直接结合 S100A13 启动子（包含预测的 SP1 结合基序 CCCCTCCCCCGCCCC，位于 -147/-132），转录激活 S100A13，进而促进骨肉瘤细胞迁移和侵袭，驱动转移。
- 主要证据
- 单细胞和 bulk RNA 测序分析显示 S100A13 在 C2_OB 亚群和转移样本中高表达，且在多个队列中与转移和不良预后相关；体外功能实验（划痕、Transwell）证明 S100A13 促进迁移侵袭；荧光素酶报告实验证明 SP1 直接激活 S100A13 启动子；SP1 敲低下调 S100A13 表达，SP1 过表达上调，而共敲低 S100A13 可逆转 SP1 过表达引起的迁移和侵袭增加。
- 研究意义
- 作者提出 S100A13 可作为骨肉瘤转移和不良预后的潜在生物标志物，并指出靶向 SP1/S100A13 轴可能具有治疗相关性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
成骨细胞亚群异质性分析
解析成骨细胞的转录异质性，识别负责转移的亚群及特征基因。
将成骨细胞聚类为五个亚群（C0-C4_OB），比较原发和转移组中各亚群比例，发现 C2_OB 在转移组富集。通过 irGSEA 和 cNMF 分析，发现 C2_OB 富集转移相关通路，并定义模块2，其中 S100A13 被鉴定为新的特征基因。
S100A13 表达与临床相关性分析
验证 S100A13 在骨肉瘤组织中的表达水平及其与转移和预后的关系。
在 bulk RNA-seq 数据集（GSE19276、TARGET、GSE14359、GSE49003）中比较 S100A13 表达，进行 ROC 分析、Kaplan-Meier 生存分析、Cox 回归分析。IHC 检测临床标本中 S100A13 蛋白水平，qRT-PCR 检测细胞系中 mRNA 水平。
S100A13 功能验证
验证 S100A13 对骨肉瘤细胞迁移、侵袭和 EMT 的影响。
在 HOS 细胞中进行 S100A13 敲低和过表达，通过伤口愈合实验、Transwell 侵袭实验评估迁移和侵袭能力。通过免疫荧光检测 E-cadherin 和 Vimentin 蛋白表达，qRT-PCR 检测 EMT 相关基因表达。
SP1 作为上游调控因子的预测和验证
预测并验证 SP1 是否直接结合 S100A13 启动子并激活其转录。
使用 JASPAR、PROMO、hTFtarget、AnimalTFDB 等数据库预测上游转录因子，发现 SP1。在 TARGET 队列中检测 SP1 和 S100A13 表达相关性。通过荧光素酶报告实验验证 SP1 对 S100A13 启动子的激活。通过 siRNA 和过表达实验验证 SP1 对 S100A13 表达的影响。
SP1-S100A13 轴功能验证
验证 SP1 是否通过上调 S100A13 促进骨肉瘤细胞迁移和侵袭。
在 HOS 细胞中敲低或过表达 SP1，进行划痕和 Transwell 实验。在 SP1 过表达的同时敲低 S100A13，观察迁移和侵袭能力的逆转。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| McCoy's 5A培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| qRT-PCR | Power SYBR Green PCR 预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 荧光素酶活性检测 | 双荧光素酶报告检测系统 | Promega | E1910 |
| 免疫荧光染色 | E-钙黏蛋白抗体 | Affinity Bioscience | BF0219 |
| 波形蛋白抗体 | Affinity Bioscience | BF8006 | |
| 免疫组织化学 | S100A13抗体 | Beijing Biosynthesis Biotechnology | bs-2617R |
| 荧光素酶活性检测 | TECAN酶标仪 | TECAN | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞转录组分析 | 数据集来源：GSE152048、GSE234187；质控标准：基因数<300、线粒体比例>10%；聚类方法：Seurat；批次校正：Harmony；CNV分析：inferCNV 阅读提示：Materials and methods: Datasets acquisition, Preprocessing and analysis of single-cell RNA sequencing data, Copy number variations(CNVs) analysis |
| 细胞培养 | 细胞系来源：中科院细胞库；生长条件：37℃、5% CO2（hFOB 1.19为33.5℃）；培养基：143B、HOS、MG63、hFOB 1.19使用DMEM，SAOS2、U2OS使用McCoy's 5A；血清浓度：SAOS2为15% FBS，其余为10% FBS；青霉素-链霉素：1% 阅读提示：Materials and methods: Cell culture |
| 细胞转染 | 转染试剂：Lipofectamine 2000；siRNA和过表达质粒来自Sangon Biotech 阅读提示：Materials and methods: Cell transfection |
| 细胞迁移和侵袭实验 | 划痕实验：6孔板，90%融合度，200μL枪头划痕，无血清培养基，0h和24h测量宽度；Transwell侵袭实验：5×10^5 cells/mL，100μL上室，600μL含10% FBS的培养基下室，48小时，Matrigel包被 阅读提示：Materials and methods: Cell migration and invasion assays |
| qRT-PCR | 使用Power SYBR Green PCR Master Mix；引物序列见补充表2；内参基因GAPDH；2^(-ΔΔCt)方法 阅读提示：Materials and methods: Quantitative real-time PCR(qRT-PCR) |
| 荧光素酶活性检测 | HEK293T细胞；共转染比例10:1（荧光素酶：Renilla）；转染试剂Lipofectamine 2000；培养48小时；检测使用TECAN微板阅读器和Dual-Luciferase® Reporter Assay System 阅读提示：Materials and methods: Luciferase activity assay |
| 免疫荧光染色 | HOS细胞；S100A13-siRNA转染48h；固定、透化、封闭条件；一抗：E-cadherin和Vimentin抗体；二抗；DAPI复染 阅读提示：Materials and methods: Immunofluorescence staining (IF) |
| 免疫组织化学 | 组织切片4μm；脱蜡、水化、微波修复（10mM柠檬酸钠缓冲液，pH6.0，95℃，15分钟）；一抗：兔抗人S100A13抗体；二抗孵育；DAB显色2分钟；苏木素复染30秒 阅读提示：Materials and methods: Immunohistochemistry (IHC) |