临床样本收集与单核细胞分离
获取动脉粥样硬化性冠心病患者外周血单核细胞，以分析STING通路组分的表达水平。
从120例患者收集外周血，分离单核细胞并冷冻保存。
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STING信号通路中的非线性双变量关联与单核细胞类型特异性表达水平差异
Nonlinear Bivariate Associations and Mononuclear Cell-Type-Specific Expression Level Differences in the STING Signalling Pathway.
实验完整度
中研究包含临床样本分析（120例和55例验证队列）及体外STING激动剂刺激实验，具有明确实验方法和验证结果，但缺乏功能获得/缺失或机制干预等更深层次的验证。
主要模型
外周血单核细胞（CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD19+ B细胞、单核细胞） 健康供者外周血单个核细胞（体外STING激动剂刺激模型）
重点核对
样本来源：动脉粥样硬化性冠心病患者及健康供者；数量：初始组CD4+ T细胞n=115、CD8+ T细胞n=99、B细胞n=108、单核细胞n=115；验证队列n=55 检测方法：限制维度细胞计数分析（rdC）结合信号放大和流式细胞术 STING激动剂处理：diABZI浓度梯度（0和1 μM的5倍系列稀释，共6个浓度），处理时间1小时 统计分析：ANOVA、Pearson相关、非线性（指数、对数、幂）回归建模，以及自然对数转换相关矩阵比较 抗体来源：STING (Thermo, MA532768)，phospho-STING (CST, 40818)等
摘要
理解细胞内信号通路至关重要，因为它们调节基本的功能活动。双变量关系在描绘临床样本中的这些通路时很有用。在我们之前的研究中，我们发现了通路组分之间的许多线性关联，并将这些相关性解释为恒流调节器。上游组分的增加与下游的相应增加相关。在此，我们通过评估来自动脉粥样硬化性冠状动脉疾病患者的人类外周血单核细胞类型特异性分子表达的方差，报告了STING通路分子的定量分析。该通路诱导I型干扰素途径依赖于T细胞和单核细胞中STING的表达水平以及B细胞中磷酸化STING的表达水平。T细胞和单核细胞中的这种关系表现出明确的线性，表明它被调节为恒流器。在B细胞中，关系是对数性的，表明一种开关机制。STING通路依赖的NFκB途径刺激也由非线性双变量关系建模的开关机制控制。这些开关发生在涉及磷酸化STING、磷酸化TBK1和磷酸化RelA的两个分支的分叉处。线性双变量关联很容易通过相关矩阵的评估捕获，而显著的非线性关系则不然。通过对数转换与非转换相关矩阵的评估，可以容易地辨别以对数或指数方式建模的非线性相关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在临床样本（动脉粥样硬化性冠心病患者外周血单核细胞）中，STING通路各组分的双变量关联是否因细胞类型而异，且是否存在线性或非线性（对数、指数、幂）调控模式？
- 核心机制
- 在T细胞和单核细胞中，STING表达水平与I型干扰素下游标志物（BDNF和磷酸化Akt）呈线性相关，表明恒流调控；在B细胞中，磷酸化STING与下游标志物呈对数相关，表明开关调控。在通路分叉处，磷酸化STING与磷酸化TBK1呈反幂关系，磷酸化TBK1与磷酸化RelA呈指数关系，表明NFκB途径受开关调控。
- 主要证据
- 来自120例冠心病患者的单核细胞（CD4+、CD8+ T细胞、B细胞、单核细胞）以及55例验证队列的rdC分析显示，STING与BDNF/磷酸化Akt在T细胞和单核细胞中呈线性相关，与磷酸化STING在B细胞中呈对数相关；磷酸化TBK1与磷酸化STING呈反幂相关，与磷酸化RelA呈指数相关。体外用STING激动剂diABZI刺激健康供者PBMC 1小时，重复了磷酸化TBK1与磷酸化RelA的指数关系，但磷酸化STING与磷酸化TBK1呈对数关系。
- 研究意义
- 该研究揭示了信号通路中非线性开关调控机制的存在，并表明结合自然对数转换相关矩阵的分析方法可以识别这些非线性关联，为理解信号通路调控和疾病发病机制提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
流式细胞术检测STING通路组分表达
定量检测不同单核细胞亚群中STING通路相关蛋白的表达水平。
使用限制维度细胞计数分析（rdC）结合信号放大，对CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B细胞和单核细胞中的11种分析物（STING, pSTING, pTBK1, pRelA等）进行检测。
双变量关联分析
评估STING通路组分之间的双变量关系，确定线性或非线性模式。
计算所有分析物对之间的Pearson相关系数，并构建非转换和自然对数转换相关矩阵，同时进行线性、指数、对数和幂回归建模。
验证队列分析
验证初始队列中发现的磷酸化TBK1与磷酸化RelA之间的指数关系。
对55例患者样本（其中27例与初始队列重叠，28例为新样本）检测磷酸化TBK1、磷酸化RelA和磷酸化IKKε的表达，并评估磷酸化GSK3β的表达。
体外STING激动剂刺激实验
在受控的体外条件下验证STING通路组分的动态关系。
用STING激动剂diABZI以不同浓度刺激6名健康供者的外周血单个核细胞1小时，然后检测磷酸化STING、磷酸化TBK1和磷酸化RelA的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
样本处理与细胞分离
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式细胞术 | BD Accuri流式细胞仪 | BD | -- |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| 蛋白检测 | STING抗体 | Thermo | MA532768 |
| 磷酸化STING (Ser366)抗体 | Cell Signalling Technology (CST) | 40818 | |
| IRF3抗体 | Abcam | 68481 | |
| NLRP3抗体 | Thermo | MA532255 | |
| BDNF抗体 | Abcam | ab108319 | |
| 磷酸化Akt (Thr308)抗体 | CST | 2965 | |
| 磷酸化TBK1 (Ser172)抗体 | CST | 5483 | |
| 磷酸化RelA (Ser536)抗体 | CST | 3033 | |
| 磷酸化ULK1 (Ser757)抗体 | CST | 14202 | |
| Traf6抗体 | Abcam | ab33915 | |
| MyD88抗体 | Abcam | ab133739 | |
| 磷酸化GSK3β (Ser9)抗体 | CST | 5558 | |
| 磷酸化IKKε (Ser172)抗体 | Bioss | bs8583R |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集与细胞分离 | 样本来源：动脉粥样硬化患者；外周血单核细胞分离方法：ficoll/hypaque密度梯度离心；冷冻保存条件：10% DMSO，液氮储存 阅读提示：详见Methods 2.1 Cell Donors和2.2 Cells |
| 流式细胞术检测 | 抗体种类及货号（见表2.3）；信号放大染色步骤；检测仪器（BD Accuri流式细胞仪）；分析软件（FlowJo）；每峰平均事件数（6246）；分析人员盲法 阅读提示：详见Methods 2.3 Reagents和2.4 Restricted Dimensional Cytometric Analysis |
| 统计分析 | 样本量：CD4+ T细胞n=115, CD8+ T细胞n=99, B细胞n=108, 单核细胞n=115；ANOVA和Pearson相关计算；非线性回归建模；自然对数转换 阅读提示：详见Methods 2.5 Statistical Analysis和Results 3.2 |
| 体外STING激动剂刺激实验 | 供者数量：6名健康志愿者；激动剂：diABZI，浓度梯度（0和1 μM的5倍系列稀释）；处理时间：1小时；培养条件：37°C，5% CO2 阅读提示：详见Results 3.3 Comparing STING Pathway Molecular Associations In vitro and Ex vivo 和图7 |