临床样本收集与单细胞悬液制备
获取健康皮肤、增生性瘢痕和酒渣鼻组织样本,制备单细胞悬液用于测序。
从健康皮肤(n=2)、增生性瘢痕(n=5)和酒渣鼻(n=5)样本中,选取每类各1例进行单细胞测序。组织经酶消化(胶原酶I、IV、透明质酸酶、DNase I)制备单细胞悬液。
Distinct diversity of skin cell populations of rhinophyma and hypertrophic scar illustrated by scRNA-seq.
研究包含单细胞测序、Western blot和免疫荧光等多种实验方法,但单细胞测序每组仅一个样本,且缺乏功能验证实验。
健康皮肤组织 增生性瘢痕组织 酒渣鼻组织
单细胞测序每组样本量N=1 组织来源:增生性瘢痕和酒渣鼻样本体积0.5 cm³,健康皮肤样本0.25 cm³ 临床样本来自单一中心(上海中医药大学附属曙光医院) 未进行基因敲除或过表达等功能验证实验 统计分析采用Student's t检验、ANOVA等
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取健康皮肤、增生性瘢痕和酒渣鼻组织样本,制备单细胞悬液用于测序。
从健康皮肤(n=2)、增生性瘢痕(n=5)和酒渣鼻(n=5)样本中,选取每类各1例进行单细胞测序。组织经酶消化(胶原酶I、IV、透明质酸酶、DNase I)制备单细胞悬液。
获得三种组织的单细胞转录组图谱,鉴定细胞类型和亚群。
使用10X Genomics平台构建文库并测序,通过CellRanger比对人类基因组,Seurat进行降维聚类,鉴定细胞类型。
比较增生性瘢痕和酒渣鼻中内皮细胞亚型的差异,寻找与纤维化相关的异常亚型。
无监督聚类鉴定出四种内皮亚型(动脉、静脉1、静脉2、淋巴),分析静脉2的基因通路和蛋白表达,并通过免疫荧光验证。
分析基质细胞亚型在三种组织中的分布和功能,探究其对纤维化的影响。
将基质细胞分为四类,通过免疫荧光和Western blot验证周细胞和平滑肌细胞包绕血管情况及成纤维细胞亚型蛋白表达。
探讨SMC_type3和SMC_type4在胶原分泌和转录调控上的差异,揭示其促纤维化功能。
分析胶原分泌能力、转录因子(CREB3L1、TWIST2)调控网络,并通过拟时序分析推断分化轨迹。
比较增生性瘢痕和正常皮肤中上皮细胞亚型,探究角质形成细胞异常在纤维化中的作用。
无监督聚类得到六种上皮细胞亚型,分析胶原表达和信号通路,并通过免疫荧光验证。
比较三种组织免疫细胞组成和功能,探究免疫浸润对愈合的影响。
鉴定出七种免疫细胞类型,评估T细胞耗竭和单核细胞功能,通过免疫荧光和Western blot验证CXCL2和CD3表达,并用CellPhoneDB分析细胞互作。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞悬液制备 | MACS组织保存液 | Miltenyi Biotec | -- |
| 胶原酶I | Worthington | -- | |
| 胶原酶IV | Worthington | -- | |
| 透明质酸酶 | Worthington | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Worthington | -- | |
| 单细胞测序 | Chromium控制器 | 10X Genomics | -- |
| Chromium单细胞3' V3.1试剂盒 | 10X Genomics | -- | |
| Qubit高灵敏度DNA检测 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Bioanalyzer 2200生物分析仪 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗COL1A1抗体 | Abconl | A22412 | |
| 抗SERPINE1抗体 | Abconl | A19096 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abconl | AS014 | |
| 抗F2R抗体 | Abconl | A5641 | |
| 抗MDK抗体 | Abconl | A0251 | |
| 抗ACKR1抗体 | Abmart | PH4105S | |
| 抗THBS1抗体 | Abmart | TD6848S | |
| 抗POSTN抗体 | Abmart | T56911S | |
| 抗DCN抗体 | Abmart | TD6543S | |
| 抗CXCL2抗体 | Abmart | PY88673S | |
| 抗CD3抗体 | Service | GB11014 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| 增强化学发光底物 | Advansta | -- | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| Image Lab软件 | Bio-Rad | v6.1 | |
| 免疫荧光 | 小鼠抗ADAM12抗体 | Santa Cruz | sc293225 |
| 兔抗NREP抗体 | Bioss | bs-0427R | |
| 兔抗平滑肌肌动蛋白抗体 | Abcam | ab124964 | |
| Alexa Fluor 488标记二抗 | ThermoFisher | A-11029 | |
| Alexa Fluor 555标记二抗 | ThermoFisher | A32732 | |
| 含DAPI封片剂 | -- | -- | |
| Nikon A1+共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8统计软件 | GraphPad | version |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 样本来源、体积、数量及伦理审批编号 阅读提示:Materials and methods, section 2.1 |
| 单细胞RNA测序 | 每组成像的样本量(N=1) 阅读提示:Materials and methods, section 2.3/2.4 |
| Western blot | 抗体稀释度(本文未明确说明)、蛋白上样量(20-30 μg)、一抗孵育时间(4°C过夜) 阅读提示:Materials and methods, section 2.10 |
| 免疫荧光 | 一抗稀释度、抗原修复条件(柠檬酸缓冲液 pH 6.0,10分钟) 阅读提示:Materials and methods, section 2.11 |