建立atRA诱导的腭裂小鼠模型
模拟环境致畸因素引起的腭裂，研究其病理机制
对E10.5孕鼠灌胃atRA（100 mg/kg）或玉米油，在E13.5至E16.5解剖胚胎观察腭部形态。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
MSX1的乙酰化触发降解损害腭发育
Acetylation-triggered degradation of MSX1 impairs palatal development.
实验完整度
高包含体外细胞实验、动物模型、转录组测序及体内拯救实验，涵盖多个独立证据层级并明确功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠胚胎腭间充质（MEPM）细胞 atRA诱导的腭裂小鼠模型 HEK293T细胞
重点核对
atRA剂量：100 mg/kg，E10.5孕鼠灌胃 慢病毒注射：3×10^8 TU/mL，100 μL PBS，E10.5腹腔注射 细胞处理：TSA 500 nM、NAM 20 mM、EX527 10 μM、MG132 10 μM K139R/K139Q突变对MSX1蛋白稳定性及凋亡的影响 SIRT1敲低或抑制对MSX1乙酰化及蛋白水平的影响
摘要
腭裂是一种常见的先天性疾病，源于胚胎腭融合失调，但驱动这一过程的翻译后修饰（PTMs）仍知之甚少。在此，我们报道赖氨酸乙酰化是控制胚胎腭间充质（EPM）细胞存活的关键MSX1蛋白稳态开关。我们在体外和体内证明，由去乙酰化酶SIRT1催化的乙酰化对MSX1蛋白稳定性的调节是EPM凋亡和腭融合的基础。在atRA诱导的腭裂模型中，SIRT1抑制驱动MSX1过度乙酰化，加速蛋白酶体降解，最终导致EPM凋亡。引人注目的是，转录组分析揭示了乙酰化的独特蛋白稳态作用，表明MSX1的结构稳定性不同于其转录活性——这一范式不同于发育过程中经典的PTM机制。慢病毒介导的去乙酰化酶SIRT1或去乙酰化模拟物MSX1 K139R的递送显著降低了腭裂严重程度，表明其在人类中的预防和治疗潜力。我们的工作将MSX1乙酰化确立为腭裂的致病驱动因素和可药物靶点，重新定义了PTM调控作为遗传疾病的核心病因因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MSX1的翻译后修饰（特别是赖氨酸乙酰化）如何调控腭发育并参与腭裂发病？
- 核心机制
- SIRT1下调导致MSX1 K139过度乙酰化，促进其泛素-蛋白酶体降解，降低MSX1蛋白水平，从而增加MEPM细胞凋亡并抑制腭融合。
- 主要证据
- 通过atRA诱导的腭裂小鼠模型、MEPM细胞培养、SIRT1敲低/抑制实验、MSX1 K139R/K139Q突变体功能实验、CHX追踪、泛素化检测及RNA-seq等证实。
- 研究意义
- 揭示MSX1乙酰化是腭裂的致病驱动因素和可药物靶点，提出SIRT1激活或K139稳定剂作为预防和治疗腭裂的潜在策略，并可能作为产前生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析腭裂中MEPM细胞增殖与凋亡
确定腭裂发生是否与细胞增殖或凋亡异常有关
通过PH3、PCNA染色检测增殖，TUNEL染色和流式细胞术检测凋亡。
检测MSX1表达及乙酰化水平
评估MSX1在腭裂中的表达变化及其是否受乙酰化调控
通过Western blot、qRT-PCR、免疫荧光和免疫沉淀检测MSX1蛋白和mRNA水平及乙酰化程度。
鉴定SIRT1为MSX1去乙酰化酶
确定调控MSX1乙酰化的关键去乙酰化酶
利用STRING数据库预测、共定位、Co-IP、GFP pulldown、siRNA敲低和EX527抑制实验验证SIRT1与MSX1的相互作用及去乙酰化功能。
确定MSX1乙酰化位点
定位MSX1上功能性乙酰化位点
通过质谱分析鉴定MSX1乙酰化位点，构建K139R、K237R、K243R突变体检测乙酰化水平，并通过序列比对分析保守性。
验证乙酰化对MEPM凋亡的影响
探究MSX1 K139乙酰化状态是否影响MEPM细胞存活
在MEPM细胞中敲低SIRT1或转染MSX1突变体（K139R、K139Q），通过TUNEL和流式检测凋亡，并利用shMSX1联合拯救实验明确K139的功能。
评估乙酰化对MSX1蛋白稳定性的影响
揭示乙酰化如何调控MSX1蛋白降解
通过CHX追踪实验检测MSX1降解速率，泛素化实验检测MSX1多聚泛素化水平，并与转录组变化比较。
转录组分析乙酰化对MSX1转录功能的影响
判断MSX1乙酰化是否影响其转录活性
对转染Vector、MSX1、K139R、K139Q的MEPM细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因及富集通路。
体内拯救实验
评估恢复MSX1稳定性或去乙酰化能否减轻腭裂
将慢病毒（Lv-NC、Lv-Sirt1、Lv-Msx1、Lv-K139R）通过腹腔注射到E10.5孕鼠，结合atRA诱导，分析腭裂发生率、腭部距离和细胞凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 全反式维甲酸 | Macklin | C12056220 |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | C11330500BT |
| 胎牛血清 | VivaCell | C04001-050 | |
| 青霉素-链霉素 | NCM Biotech | C100C5 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200072 | |
| 药物处理 | 烟酰胺 | Aladdin | N105042 |
| 曲古抑菌素A | Beyotime | S1893 | |
| EX527 | MCE | HY-15452 | |
| MG132 | MCE | HY-13259 | |
| 抗体 | pH3抗体 | Santa-Cruz | A2971 |
| PCNA抗体 | Boster | BM0104 | |
| MSX1抗体 | Bioss | bs-8512R | |
| 乙酰化赖氨酸抗体 | Santa-Cruz | sc-32268 | |
| SIRT1抗体 | Santa-Cruz | sc-74465 | |
| CBP抗体 | Santa-Cruz | sc-7300 | |
| p300抗体 | Santa-Cruz | sc-48343 | |
| GFP抗体 | Santa-Cruz | sc-9996 | |
| 泛素抗体 | Cell Signaling | 3936 | |
| β-微管蛋白抗体 | Affinity | T0023 | |
| GAPDH抗体 | Affinity | T0004 | |
| 慢病毒包装 | 慢病毒 | GenePharma | -- |
| 荧光染色 | DAPI | Beyotime | C1005 |
| 细胞凋亡检测 | 原位细胞死亡检测试剂盒 | Roche | 12156792910 |
| Annexin-V-FITC和碘化丙啶 | -- | -- | |
| 细胞培养 | HEK293T细胞系 | ATCC | CRL-11268 |
| 质粒构建 | pmEGFP-N2载体 | Clontech | -- |
| pET-MBP-3C载体 | -- | -- | |
| Flag标签的人泛素B | iGeneBIO | -- | |
| 转染 | ExFect转染试剂 | Vazyme | T101-01 |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668019 | |
| RNA提取 | FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒 | Vazyme | RC112 |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | 15596026 |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白质印迹 | 5×SDS缓冲液 | Beyotime | P0015 |
| PVDF膜 | Millipore | ISEQ00010 | |
| 化学发光成像仪 | Tanon | -- | |
| 免疫沉淀 | IP细胞裂解液 | Beyotime | P0013J |
| Protein A+G磁珠 | Beyotime | T2108 | |
| 重组蛋白表达 | 大肠杆菌BL21(DE3)-Rosetta感受态细胞 | TIANGEN | CB108 |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | Yeason | 10902ES08 | |
| 重组蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖 | QIAGEN | 163026181 |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL 凝胶柱 | -- | -- | |
| 蛋白浓度测定 | BCA蛋白定量试剂盒 | Vazyme | E112-01 |
| 重组蛋白 | 重组His6-SIRT1蛋白 | MCE | HY-P71596 |
| 仪器 | 旋转切片机 | Leica | RM2265 |
| 显微镜 | Leica | DM4000 | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| qRT-PCR | 实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | ABI7300 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | atRA剂量、给药方式、给药时间、对照组 阅读提示：见Materials and Methods中的Animals、Histology analyses |
| 细胞培养 | MEPM细胞分离方法、培养条件、细胞系来源 阅读提示：见Materials and Methods中的Cell culture |
| 药物处理 | NAM、TSA、EX527、MG132、CHX的浓度和处理时间 阅读提示：见Materials and Methods中的Cell culture及相应图注 |
| 质粒转染 | 转染试剂、质粒构建、突变体 阅读提示：见Materials and Methods中的Plasmids, shRNAs and siRNAs |
| 蛋白质检测 | 抗体、IP/Co-IP条件、Western blot步骤 阅读提示：见Materials and Methods中的Protein extraction and western blotting, Immunoprecipitation (IP) and Co-IP |
| 体内拯救实验 | 慢病毒滴度、注射方式、注射时间、分组 阅读提示：见Materials and Methods中的In vivo lentiviral overexpression及图6A |
| RNA-seq分析 | 建库测序平台、比对方法、差异基因阈值 阅读提示：见Materials and Methods中的Transcriptome Sequencing Analysis |