IECs的分离、鉴定与生长曲线测定
获取并验证原代羔羊肠道上皮细胞模型。
从羔羊十二指肠分离IECs，通过CK-19免疫荧光鉴定，并用CCK-8法测定细胞活力，绘制生长曲线。
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超声裂解粪肠球菌F11.1G修复LPS诱导的肠道上皮细胞炎性损伤的机制：基于RNA-seq和LC-MS
The Mechanism of Ultrasonic Lysis of Enterococcus faecium F11.1G in Repairing LPS-Induced Inflammatory Damage in IECs via RNA-seq and LC-MS.
实验完整度
高包含原代细胞模型、转录组、代谢组及蛋白水平验证（IF/WB），多证据层级验证抗炎机制。
主要模型
原代羔羊肠道上皮细胞（IECs） LPS诱导的IECs炎症损伤模型 超声破碎的粪肠球菌F11.1G（F11.1G）
重点核对
LPS浓度：5 μg/mL，处理时间：6 h F11.1G浓度：108 CFU/mL，处理时间：3 h 实验分组：NC、LPS（5 μg/mL LPS 6 h）、LPSF（5 μg/mL LPS 6 h + 108 CFU/mL F11.1G 3 h） 生物学重复：转录组和代谢组n=6，细胞实验n=3 WB验证目标蛋白：TLR4、MyD88、p-p65、p-p38
摘要
脂多糖（LPS）诱导的肠道上皮屏障损伤导致肠道炎症，乳酸菌的胞内代谢物可能参与调节这一过程从而发挥益生作用。本研究旨在探讨超声破碎处理的粪肠球菌F11.1G（F11.1G）对模型（原代羔羊IECs + 5 μg/mL LPS处理6小时）的修复效应及分子机制。结果表明，108 CFU/mL F11.1G显著抑制了LPS诱导的促炎因子（IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α）的过度分泌。基因本体（GO）分析显示，差异表达基因（DEGs）主要富集于对脂多糖的细胞反应、炎症反应和经典NF-κB信号通路。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析显示富集于NF-κB信号通路和MAPK信号通路。PPI网络鉴定了包括IL-1β、TNF、IL-8、RELB、FOS、TNFAIP3、NFKBIA和MMP9在内的关键基因。KEGG分析显示差异丰度代谢物（DAMs）富集于嘌呤代谢和内源性大麻素系统。Spearman相关分析显示促炎基因与内源性保护性代谢物（如腺苷和PEA）呈正相关，而与多种嘌呤代谢物呈负相关。相关分析表明，F11.1G主要通过抑制NF-κB/MAPK通路激活来减轻肠道炎症损伤，并可能协同调节嘌呤和内源性大麻素代谢。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 超声裂解的粪肠球菌F11.1G能否修复LPS诱导的肠道上皮细胞炎症损伤，其分子机制是什么？
- 核心机制
- F11.1G通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB/MAPK信号通路的激活，减少促炎因子（IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α）的分泌，并可能协同调节嘌呤代谢和内源性大麻素系统（如腺苷和PEA）来发挥抗炎作用。
- 主要证据
- 基于RNA-seq和LC-MS的多组学分析，结合RT-qPCR、ELISA、IF和WB验证，显示F11.1G显著降低LPS诱导的促炎因子表达，并抑制p-p65和p-p38的核转位及蛋白表达。
- 研究意义
- 研究为超声裂解的粪肠球菌F11.1G作为后生元制剂缓解肠道炎症的潜力提供了实验证据，并表明其通过多靶点调控炎症信号通路和代谢网络发挥抗炎作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LPS诱导IECs炎症损伤模型的建立
确定LPS诱导IECs炎症损伤的最佳浓度和时间。
用不同浓度（0, 1, 5, 10, 20 μg/mL）LPS处理IECs不同时间（3, 6, 12, 24 h），检测细胞活力、促炎因子（IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α）和抗炎因子IL-10的表达。
F11.1G的制备与细胞毒性评估
制备超声裂解的F11.1G并评估其对IECs的细胞毒性。
将粪肠球菌F11.1G培养后离心，用PBS洗涤，超声破碎，收集上清得到F11.1G。用不同浓度（10^6, 10^7, 10^8, 10^9 CFU/mL）F11.1G处理IECs 3或6 h，检测细胞活力和炎症因子表达。
F11.1G对LPS诱导损伤的修复效果评估
筛选对LPS损伤IECs具有修复作用且无细胞毒性的F11.1G浓度。
用不同浓度（10^6, 10^7, 10^8, 10^9 CFU/mL）F11.1G处理LPS损伤的IECs 3 h，通过CCK-8、RT-qPCR和ELISA评估细胞活力及炎症因子表达。
转录组学分析（RNA-seq）
揭示F11.1G修复LPS损伤的差异表达基因及其富集的信号通路。
对NC、LPS、LPSF组细胞进行RNA-seq，鉴定DEGs，进行GO和KEGG富集分析，构建PPI网络并筛选关键基因。
代谢组学分析（LC-MS）
鉴定F11.1G修复LPS损伤的差异丰度代谢物及其相关代谢通路。
对NC、LPS、LPSF组的细胞上清进行LC-MS非靶向代谢组学分析，鉴定DAMs，进行KEGG富集分析，并筛选高置信度DAMs。
DEGs与DAMs的关联分析
探究F11.1G修复过程中基因表达与代谢物变化的协同关系。
对DEGs和DAMs进行Spearman相关分析，基于|R| > 0.7且FDR < 0.01，构建基因-代谢物相互作用网络。
信号通路活性验证
验证F11.1G对NF-κB和MAPK信号通路的抑制作用。
通过免疫荧光（IF）检测p-p65和p-p38的核转位，通过Western blot检测TLR4、MyD88、p-p65、p-p38等蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
代谢组学分析
关联分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Cellverse Co., Ltd. | PriMed-iCell-001 |
| 胎牛血清 | Cellverse Co., Ltd. | iCell-0500-1 | |
| 青霉素-链霉素 | Cellverse Co., Ltd. | iCell-15140-122 | |
| CO2培养箱 | Eppendorf | C170 | |
| 免疫荧光 | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | Solarbio | S9070 | |
| 抗细胞角蛋白19抗体 | Proteintech | 10712-1-AP | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00006-2 | |
| DAPI | Solarbio | C0060 | |
| 倒置荧光显微镜 | Nikon | DS-Ri2 | |
| 细胞活性检测 | CCK-8试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 酶标仪 | BioTek Instruments | H1 | |
| 炎症模型建立 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L2880 |
| 细胞因子检测 | ELISA试剂盒 | Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. | YL32272, |
| RNA提取 | TransZol Up Plus RNA提取试剂盒 | TransGen Biotech | ER501 |
| RNA质量检测 | NanoDrop 8000分光光度计 | NanoDrop Technologies | -- |
| 逆转录 | Takara反转录试剂盒 | TaKaRa Bio | RR097A |
| RT-qPCR | CFX96实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| SYBR Green实时荧光定量PCR预混液 | TransGen Biotech | S31025 | |
| 细菌培养 | MRS肉汤 | -- | -- |
| F11.1G制备 | 高速冷冻离心机 | Thermo Scientific | -- |
| 转录组测序 | TRIzol试剂 | Invitrogen Life Technologies | 15596018CN |
| RNA-seq文库构建 | AMPure XP磁珠纯化系统 | Beckman Coulter | -- |
| RNA-seq文库质量控制 | Bioanalyzer 2100系统 | Agilent | -- |
| RNA测序 | NovaSeq 6000平台 | Illumina | -- |
| 代谢组学样品制备 | 冷冻干燥机 | -- | -- |
| 代谢组学色谱分离 | ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱 | Waters | -- |
| 代谢组学质谱分析 | Thermo Orbitrap Exploris 120质谱仪 | Thermo | -- |
| 代谢组学数据采集 | Xcalibur软件 | Thermo | version |
| 免疫荧光 | 抗磷酸化p65抗体 | BIOSS | BS-23303R |
| 抗磷酸化p38抗体 | Service-bio | GB153880 | |
| HRP标记山羊抗兔抗体 | Service-bio | GB23303 | |
| Western blot | 抗TLR4抗体 | Service-bio | GB11519 |
| 抗MyD88抗体 | Proteintech | 23230-1-AP | |
| 抗p65抗体 | Service-bio | GB11997 | |
| 抗磷酸化p65抗体 | BIOSS | BS-23303R | |
| 抗p38抗体 | BIOSS | BS-0637R | |
| 抗磷酸化p38抗体 | Service-bio | GB153880 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Service-bio | GB15003 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原代IECs的分离与培养 | 细胞来源：羔羊十二指肠；培养基：DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 青霉素-链霉素；培养条件：37 °C，5% CO2 阅读提示：Methods 2.1 |
| LPS诱导炎症损伤模型 | LPS浓度：5 μg/mL；处理时间：6 h；细胞密度：2 × 10^4 cells/mL 阅读提示：Methods 2.2，Results 3.3，Figure 2，Figure 3 |
| F11.1G的制备 | 细菌培养条件：MRS肉汤，37 °C，24 h，厌氧；超声破碎条件：冰浴中超声15 min；上清储存：-20 °C 阅读提示：Methods 2.3 |
| F11.1G修复处理 | F11.1G浓度：108 CFU/mL；处理时间：3 h；处理顺序：先LPS 6 h，再F11.1G 3 h 阅读提示：Methods 2.5，Results 3.5，Figure 4 |
| 转录组学分析 | 分组：NC、LPS、LPSF；生物学重复：n = 6；测序平台：NovaSeq 6000；DEG筛选标准：|log2(FoldChange)| > 1.2，校正p < 0.05 阅读提示：Methods 2.6，Results 3.6，Figure 5 |
| 代谢组学分析 | 分组：NC、LPS、LPSF；生物学重复：n = 6；样本类型：细胞培养上清；色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3；质谱仪：Thermo Orbitrap Exploris 120；DAM筛选标准：FDR < 0.01，FC > 1，VIP > 1 阅读提示：Methods 2.7，Results 3.7，Figure 6 |
| 信号通路验证 | IF检测p-p65和p-p38；WB检测TLR4、MyD88、p-p65、p-p38；抗体稀释度：anti-phospho-p65 (1:2000或1:1000)，anti-phospho-p38 (1:5000或1:1000)；内参：β-actin 阅读提示：Methods 2.8，2.9，Results 3.9，Figure 8 |