构建野生型及突变型HBV质粒和S蛋白表达质粒
建立实验工具以研究C138R突变对HBsAg功能的影响。
构建全长HBV基因组质粒HBV 1.3及其突变体HBV C138R，并构建HA标签的S蛋白表达质粒sWT及C138R突变体sC138R，以及C107R、C124R、C147R突变体用于研究其他二硫键的作用。
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S基因C138R突变导致HBsAg抗原性和分泌双重缺陷从而引发隐匿性乙型肝炎病毒感染
Dual defects in HBsAg antigenicity and secretion caused by the C138R mutation in the S gene trigger occult hepatitis B virus infection.
实验完整度
高包含细胞水平（Huh7、HepG2、HEK293T）功能验证、HBV DNA及RNA定量、Western blot和免疫荧光，以及小鼠体内模型验证，机制涉及二硫键和二聚体形成。
主要模型
Huh7细胞系 HepG2细胞系 HEK293T细胞系 BALB/c小鼠
重点核对
HBV 1.3质粒（野生型）和HBV C138R突变质粒 HA标签的S蛋白表达质粒（sWT和sC138R） 转染试剂Lipofectamine 3000 细胞类型（Huh7、HepG2、HEK293T） 体内模型：BALB/c小鼠（6-8周龄，雄性）
摘要
隐匿性乙型肝炎病毒（HBV）感染（OBI）具有较高的传播和致病风险。S基因突变被认为是OBI发生的主要因素之一。我们先前的研究在OBI患者中发现了S基因的C138R突变。本研究旨在探讨C138R突变对HBsAg功能的影响及其导致OBI的机制。构建了全长HBV质粒（HBV 1.3，基因型B）及突变质粒（HBV C138R），以及HA标签的野生型（sWT）和突变型（sC138R）S蛋白表达质粒。通过体外细胞转染和体内小鼠尾静脉高压注射，评估了C138R突变对HBsAg抗原性、分泌和二聚体形成的影响。C138R突变显著降低了细胞内和细胞外HBsAg水平，但不影响HBV转录、复制或其他病毒蛋白的表达。HA标签检测表明，这种降低是由于抗原性受损所致。多个商业ELISA试剂盒结果和细胞上清中的HA水平表明，C138R突变也损害了HBsAg的分泌。同样，C107R突变显著降低了HBsAg的抗原性和分泌。非还原性Western blot和基于AlphaFold 3的结构预测显示，C138R突变导致HBsAg形成异常二聚体。这些发现在小鼠模型中得到了证实。C138R突变通过同时损害HBsAg的抗原性和分泌，促进了OBI的发生。aa107和aa138之间二硫键的破坏导致结构异常二聚体的形成，是该突变引起HBsAg功能障碍的主要机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- S基因C138R突变如何影响HBsAg功能并导致隐匿性HBV感染？
- 核心机制
- C138R突变破坏了aa107和aa138之间的二硫键，导致HBsAg形成异常构象的二聚体，从而降低其抗原性和分泌效率。
- 主要证据
- 体外转染实验显示C138R突变降低HBsAg水平和分泌，但HA表达未下降；非还原性WB显示二聚体带减少，AlphaFold 3预测显示突变体二聚体构象差异；小鼠模型验证了降低的HBsAg抗原性、分泌和免疫原性。
- 研究意义
- 研究阐明了C138R突变导致OBI的机制，为OBI的发病机制和临床诊断提供了理论基础和新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞培养与转染
在体外细胞模型中评估C138R突变对HBsAg表达、分泌和抗原性的影响。
将野生型或突变型质粒转染至Huh7、HepG2和HEK293T细胞，转染后48小时收集细胞和上清进行检测。
检测HBsAg水平及病毒学指标
评估C138R突变对HBsAg表达的影响以及是否影响其他病毒复制步骤。
通过化学发光、ELISA、Western blot和免疫荧光检测HBsAg水平；通过定量PCR检测HBV RNA和DNA；通过化学发光和Western blot检测HBeAg和HBcAg。
评估HBsAg抗原性和分泌功能
区分C138R突变对HBsAg抗原性的影响和对分泌的影响。
使用HA标签的S蛋白质粒，通过检测细胞内和细胞外的HA和HBsAg水平，以及计算EC/IC比率，评估抗原性和分泌效率。
分析突变对二硫键和二聚体形成的影响
验证C138R突变是否破坏关键二硫键并导致异常二聚体形成，以及这些异常是否影响抗原性和分泌。
构建C107R、C124R和C147R突变体，破坏特定的二硫键，用非还原性WB检测二聚体形成，用还原性WB检测单体水平，并用AlphaFold 3预测SHBs二聚体构象。
体内小鼠模型验证
在动物体内验证C138R突变对HBsAg抗原性、分泌和免疫原性的影响。
通过尾静脉高压注射将HBV 1.3或HBV C138R质粒注入BALB/c小鼠，在不同时间点采集血清和肝脏组织，检测HBsAg、抗-HBs水平和肝内HBsAg表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000-015 |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985070 | |
| 蛋白检测 | 抗-HBs抗体 | Bioss | bs-1557G |
| 抗HA标签抗体 | CST | C29F4 | |
| 抗HBcAg抗体 | Abcam | ab8637 | |
| GAPDH抗体 | Huabio | ET1601-4 | |
| RNA检测 | SYBR Premix Ex Taq | Vazyme | Q311 |
| DNA检测 | 乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒 | Shengxiang | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| ELISA | ELISA试剂盒1 | InTec PRODUCTS, INC. (Xiamen) | -- |
| ELISA试剂盒2 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. | -- | |
| ELISA试剂盒3 | Shanghai Rongsheng Biotech Co., Ltd. | -- | |
| ELISA试剂盒4 | Shanghai Kehua Bio-Engineering Co., Ltd. | -- | |
| 仪器设备 | Abbott ARCHITECT i2000SR全自动免疫分析仪 | Abbott | -- |
| 荧光显微镜 | ZEISS正置荧光显微镜 | ZEISS | -- |
| 结构预测 | AlphaFold 3 | -- | -- |
| 结构可视化 | PyMOL | -- | -- |
| 数据分析 | GraphPad Prism 8.0 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 质粒构建 | HBV 1.3质粒（基因型B，adw2亚型，GenBank: AY220698.1）及其C138R突变质粒；HA标签的sWT和sC138R质粒 阅读提示：材料与方法中“Construction of various plasmids”部分 |
| 细胞培养与转染 | 细胞系（Huh7、HepG2、HEK293T）；培养条件（DMEM+10%FBS+1%青霉素-链霉素，37°C，5% CO2）；转染条件（1.5μg DNA + 3μL Lipofectamine 3000，Opti-MEM中孵育15分钟，6小时后换液，继续培养48小时） 阅读提示：材料与方法中“Cell culture and transfection”部分 |
| HBsAg抗原性和分泌检测 | 使用Abbott ARCHITECT i2000SR检测HBsAg和HBeAg；使用四种商业ELISA试剂盒检测细胞内和细胞外HBsAg；使用非还原性WB检测二聚体形成；使用还原性WB检测单体表达；计算EC/IC比率评估分泌效率 阅读提示：材料与方法中“Quantification of various viral proteins”部分及图4图例 |
| RNA和DNA检测 | RNA检测使用SYBR Premix Ex Taq，β-actin作为内参；HBV DNA检测使用商业试剂盒（Shengxiang） 阅读提示：材料与方法中“Quantification of intracellular RNA”和“Quantification of HBV DNA”部分 |
| 免疫荧光 | 细胞固定用4%多聚甲醛，透化用0.25% Triton X-100，封闭用1% BSA；一抗孵育过夜（4°C），二抗孵育1小时（室温） 阅读提示：材料与方法中“Immunofluorescence (IF) staining”部分 |
| 动物实验 | 雄性BALB/c小鼠（6-8周龄）；尾静脉高压注射10μg质粒（0.1mL/g体重）；采样时间点：第1、3、5、7、10、14、21天采血，第3、7、21天取肝脏 阅读提示：材料与方法中“Construction of HBV model in mice”和“Serological testing and liver immunohistochemical detection”部分 |
| 结构预测 | AlphaFold 3预测SHBs二聚体结构；PyMOL可视化 阅读提示：材料与方法中“Analysis of structural characteristics of SHBs dimers”部分 |