结构设计与验证
设计并验证RBD-GP96融合蛋白的结构稳定性和抗原暴露。
使用AlphaFold3预测结构，分子动力学模拟，表达纯化融合蛋白，并通过凝胶过滤、超速离心、TEM、SPR和ELISA验证其稳定性和hACE2结合能力。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
通过gp96融合策略的替代性抗原保留在小鼠中诱导长效且广泛的免疫
Alternative antigen retention by a gp96-fusion approach induces long-lasting and broad immunity in mice.
实验完整度
高包含体外结构验证（SPR、ELISA、分子动力学）、小鼠免疫模型（BALB/c、HLA-A2转基因、hACE2）、病毒攻毒、肿瘤模型、单细胞RNA测序及功能验证。
主要模型
BALB/c小鼠 HLA-A2转基因小鼠 hACE2转基因小鼠 HeLa异种移植裸鼠模型
重点核对
抗原-GP96融合蛋白的N端融合策略 疫苗免疫剂量：20μg RBD-GP96-Fusion SARS-CoV-2攻毒模型：hACE2小鼠，XBB.1.22毒株 HPV E7肿瘤模型：HeLa异种移植，CD8+ T细胞过继转移
摘要
高效地将抗原递送至B细胞和树突状细胞（DC）对于增强疫苗免疫原性至关重要。在此，我们开发了一种二聚体疫苗策略，通过将抗原融合至热休克蛋白GP96的N端。该平台生成紧凑的纳米级颗粒，完全暴露抗原位点。我们使用SARS-CoV-2受体结合域（RBD）抗原在hACE2小鼠的病毒攻毒模型中，以及人乳头瘤病毒（HPV）E7蛋白在裸鼠的HeLa异种移植模型中验证了该疫苗策略。GP96部分直接结合其受体LRP1，从而增强抗原在滤泡树突状细胞上的积累并延长淋巴结滞留时间，最终放大生发中心B细胞反应。此外，DC上的GP96-LRP1相互作用促进抗原内吞，支撑表位呈递和强大的交叉保守T细胞激活。因此，这种设计诱导强效、持久的体液免疫、交叉保守的T细胞反应和肺黏膜免疫，凸显其作为通用且有效的疫苗接种策略的前景。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何设计一种疫苗策略，以增强抗原的免疫原性并诱导长效、广泛的体液和细胞免疫反应。
- 核心机制
- GP96融合蛋白通过其GP96部分结合LRP1受体，促进抗原在滤泡树突状细胞上的积累和淋巴结滞留，增强生发中心B细胞反应及抗原交叉呈递，从而诱导强效持久的抗体和T细胞反应。
- 主要证据
- 通过SPR、ELISA、结构预测和分子动力学验证融合蛋白稳定性与hACE2结合；小鼠免疫实验显示RBD-GP96-Fusion诱导更高抗体滴度和T细胞反应；攻毒实验和肿瘤模型显示保护效果。
- 研究意义
- 该策略为开发高效广谱疫苗提供新平台，有望应用于流感等高突变病原体。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内稳定性和迁移
评估RBD-GP96-Fusion在小鼠体内的稳定性和淋巴结迁移。
将荧光标记的RBD-GP96-Fusion皮下注射小鼠，通过活体成像监测注射部位和淋巴结的荧光信号持续时间。
体液免疫评估
评估RBD-GP96-Fusion疫苗诱导的抗体反应和中和活性。
免疫BALB/c小鼠三次，检测血清中RBD特异性IgG亚型、交叉反应、中和抗体滴度、ADCC活性，并比较不同佐剂。
GC和记忆B细胞分析
评估疫苗诱导的生发中心B细胞和记忆B细胞反应。
通过流式细胞术分析引流淋巴结中的GC B细胞和记忆B细胞前体，并通过ELISPOT检测骨髓中的抗体分泌细胞。
T细胞免疫评估
评估疫苗诱导的T细胞反应，特别是CD8+ T细胞和黏膜免疫。
通过ICS、AIM、ELISPOT检测脾脏和BALF中的T细胞反应，并分析组织驻留记忆T细胞。
机制研究
阐明GP96-LRP1相互作用在抗原保留和交叉呈递中的作用。
通过流式细胞术和免疫共沉淀验证FDC上的LRP1结合，并使用活细胞成像观察FDC与GC B细胞相互作用，以及BMDC上的抗原摄取和交叉呈递。
体内保护效果
评估疫苗在SARS-CoV-2攻毒和HPV肿瘤模型中的保护效果。
hACE2小鼠接种疫苗后鼻内攻毒XBB.1.22，检测病毒载量和肺病理；裸鼠接种HeLa细胞后过继转移免疫CD8+ T细胞，监测肿瘤生长。
HPV疫苗验证
验证GP96融合策略对HPV L1和E7抗原的适用性。
构建L1-GP96-Fusion和E7-GP96-Fusion，免疫HLA-A2转基因小鼠，检测抗体、T细胞反应和细胞毒性，并用E7-GP96-Fusion进行肿瘤模型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
结构预测与建模
单细胞测序
细胞功能实验
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达纯化 | pFastBac1载体 | Invitrogen | -- |
| HisTrap HP柱 | GE Healthcare | -- | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | -- | |
| 分析超速离心 | Proteome Lab XL-I | Beckman Coulter | -- |
| 透射电镜 | JEM-1400透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| 表面等离子共振 | BIAcore 3000 | GE Healthcare | -- |
| 热稳定性分析 | PR.NT.48纳米差示扫描荧光仪 | NanoTemper Technologies | -- |
| ELISA | Nunc Maxisorp平底96孔板 | Invitrogen | 44-2404-21 |
| TMB底物 | Thermo Scientific | 34021 | |
| ADCC | Jurkat-mFcγRIII-NFAT-Luc报告细胞 | Promega | M1211 |
| 荧光标记 | Lightning-Link R-Cy5标记试剂盒 | Abcam | ab188288 |
| Lightning-Link R-APC/Cy7标记试剂盒 | Abcam | ab102859 | |
| Lightning-Link R-PE/Cy5标记试剂盒 | Abcam | ab102893 | |
| 流式细胞术 | 细胞染色缓冲液 | BioLegend | 420201 |
| 固定/透化稀释液 | eBioscience | 00-5223-56 | |
| ELISPOT | MultiScreen HTS IP滤板 | Millipore Sigma | MSIPS4W10 |
| BD ELISPOT AEC底物套装 | BD Biosciences | 551951 | |
| CTL Immunospot分析仪 | CTL | -- | |
| 抑制剂阻断 | Fc受体阻断试剂 | Miltenyi Biotec | 130-092-575 |
| TLR1单克隆抗体 | Abcam | ab37068 | |
| TLR2单克隆抗体 | Abcam | ab209216 | |
| TLR4单克隆抗体 | Abcam | ab22048 | |
| LRP1单克隆抗体 | Abcam | ab92544 | |
| 免疫共沉淀 | RBD单克隆抗体 | Abclonal | A23771 |
| GRP94 (GP96)单克隆抗体 | CST | 20292T | |
| LRP1单克隆抗体 | Abcam | ab92544 | |
| Western blot | HPV18 L1单克隆抗体 | Abcam | ab267404 |
| 活细胞成像 | LRP1阻断单克隆抗体 | R&D Systems | -- |
| 大鼠IgG2a同型抗体 | eBioscience | -- | |
| Nikon A1倒置显微镜 | Nikon | -- | |
| 单细胞测序 | BD FACS Aria III流式分选仪 | BD Biosciences | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 共聚焦染色 | LRP1单克隆抗体 | Abcam | ab92544 |
| RBD单克隆抗体 | Abclonal | A23771 | |
| EEA1单克隆抗体 | CST | 2411S | |
| Rab7单克隆抗体 | Abcam | ab126712 | |
| LAMP1单克隆抗体 | CST | 9091S | |
| Calnexin多克隆抗体 | Abcam | ab22595 | |
| RBD多克隆抗体 | Sino Biological | 40592-MP01 | |
| 抗小鼠TRITC二抗 | OriGene | ZF-0313 | |
| 抗兔FITC二抗 | OriGene | ZF-0311 | |
| 体外杀伤实验 | 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯 | -- | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Corning | 35-015 | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- | |
| 白细胞介素-4 | PeproTech | -- | |
| 细胞刺激 | PMA/离子霉素 | -- | -- |
| 布雷菲德菌素A | Invitrogen | 00-4506-51 | |
| ELISA定量 | 小鼠抗HPV16 L1 IgG ELISA试剂盒 | Alpha Diagnostic International | 550-316-PMG |
| 小鼠抗HPV18 L1 IgG ELISA试剂盒 | Alpha Diagnostic International | 550-318-PMG | |
| 小鼠抗HPV31 L1 IgG ELISA试剂盒 | Alpha Diagnostic International | 550-331-PMG | |
| 小鼠抗HPV45 L1 IgG ELISA试剂盒 | Alpha Diagnostic International | 550-345-PMG | |
| 肿瘤模型 | CD8+ T细胞分选试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19853 |
| 病毒中和实验 | Vero细胞 | ATCC | -- |
| 组织消化 | 胶原酶IV | Sigma-Aldrich | -- |
| ACK裂解缓冲液 | Lonza | 10-548E | |
| Hank's平衡盐溶液 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、年龄、来源 阅读提示：Methods: Mice |
| 疫苗免疫 | 免疫剂量、佐剂、注射途径、时间点 阅读提示：Methods: Immunization |
| 攻毒实验 | 病毒株、剂量、攻毒途径、观察时间 阅读提示：Methods: Mice immunizing and viruses challenging |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号、稀释比例、染色步骤 阅读提示：Methods: ICS and immunophenotyping by flow cytometry |
| 肿瘤模型 | 细胞类型、接种数量、过继转移T细胞的数量和时机 阅读提示：Methods: Animal tumor model and adoptive therapy |