临床样本中RPL35A表达分析
评估RPL35A在肺癌组织中的表达水平及其与预后的相关性
利用TCGA RNA-seq数据（516例肺腺癌和59例正常组织）分析RPL35A表达；使用组织芯片（88例肺癌组织和77例癌旁组织）进行IHC染色，通过Kaplan-Meier分析评估与总生存期的关系。
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RPL35A通过促进MYC介导的SKP2转录驱动有氧糖酵解和肿瘤发生
RPL35A drives aerobic glycolysis and tumorigenesis by facilitating MYC-mediated SKP2 transcription.
实验完整度
高包含临床样本IHC和TCGA数据库分析、细胞功能验证（增殖/迁移/凋亡）、机制验证（Co-IP、ChIP、荧光素酶报告基因）、代谢检测和体内异种移植模型。
主要模型
A549细胞系 NCI-H1299细胞系 BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型 肺癌患者组织样本（组织芯片）
重点核对
RPL35A在肺癌组织中的表达水平（IHC评分）及其与预后的相关性 细胞系中RPL35A敲低或过表达的效率（shRNA或过表达载体） RPL35A与MYC的相互作用及MYC核转位（Co-IP和亚细胞分离） MYC结合SKP2启动子的能力（ChIP-qPCR） 糖酵解指标：葡萄糖摄取、乳酸产生、ATP水平、ECAR、OCR
摘要
作为一种核糖体蛋白，RPL35A参与多种细胞过程，但其在肺癌中的作用仍不清楚。在此，我们证明RPL35A在肺癌组织中表达上调，并与患者预后不良相关。功能研究表明，RPL35A过表达增强肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，同时抑制凋亡；相反，RPL35A敲低则产生相反的效果。体内异种移植模型证实，RPL35A缺失显著抑制肿瘤生长。机制上，RPL35A通过其N端结构域（氨基酸2–22）直接与癌蛋白MYC相互作用，促进MYC核转位及其向SKP2启动子的募集。这种相互作用驱动SKP2表达，导致有氧糖酵解激活，表现为葡萄糖摄取、乳酸产生和细胞外酸化率增加。缺失2至22残基基序（RPL35A-Δ1）可消除MYC结合，并且在拯救实验中无法恢复SKP2表达或糖酵解活性。此外，RPL35A的致癌作用可被糖酵解抑制所消除，证实代谢重编程是关键的效应下游环节。总的来说，我们的发现表明RPL35A可能作为肺鳞状细胞癌（LUSC）患者有价值的预后生物标志物和有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RPL35A在肺癌中的表达模式、功能作用及其分子机制尚不清楚，本研究旨在明确RPL35A在肺癌进展中的作用及其机制。
- 核心机制
- RPL35A通过其N端2-22氨基酸残基与MYC直接相互作用，促进MYC核转位及其在SKP2启动子上的募集，从而转录激活SKP2，增强有氧糖酵解，促进肺癌细胞增殖、迁移并抑制凋亡。
- 主要证据
- 通过TCGA数据分析、IHC、细胞实验（CCK-8、EdU、划痕、Transwell、流式凋亡）、Co-IP、ChIP、双荧光素酶报告基因、代谢检测（葡萄糖摄取、乳酸、ATP、ECAR、OCR）以及体内裸鼠异种移植实验，证明RPL35A通过MYC-SKP2轴调控有氧糖酵解和肿瘤进展。
- 研究意义
- RPL35A可能作为肺鳞状细胞癌（LUSC）患者的预后生物标志物和有前景的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞功能实验（敲低和过表达）
探究RPL35A对肺癌细胞增殖、迁移、凋亡的影响
在A549和NCI-H1299细胞中建立RPL35A敲低和过表达模型，通过CCK-8、EdU、划痕愈合、Transwell和流式凋亡检测细胞功能。
代谢表型分析
验证RPL35A对肺癌细胞有氧糖酵解的影响
通过检测糖酵解酶表达、葡萄糖消耗、乳酸产生、ATP水平、ECAR和OCR，评估RPL35A敲低或过表达后的代谢变化，并使用糖酵解抑制剂2-DG处理过表达细胞验证其依赖性。
机制探究：RPL35A与MYC相互作用
研究RPL35A是否通过与MYC相互作用调控SKP2转录
通过Co-IP验证RPL35A与MYC的相互作用；通过亚细胞分离检测核转位；通过ChIP-qPCR检测MYC与SKP2启动子的结合；通过双荧光素酶报告基因检测启动子活性。
功能域鉴定与回补实验
确定RPL35A与MYC相互作用的关键结构域，并验证其功能必要性
通过一系列RPL35A截短突变体进行Co-IP，确定2-22氨基酸残基为关键区域；在RPL35A敲低细胞中回补野生型RPL35A或Δ1突变体，检测MYC结合、SKP2表达、糖酵解和细胞表型。
体内异种移植模型
评估RPL35A敲低对体内肿瘤生长的影响
将RPL35A敲低或对照A549细胞皮下注射入裸鼠，观察肿瘤生长，测量体积和重量，并通过Western blot、H&E和IHC分析肿瘤组织。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | F-12营养培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| RNA提取和qRT-PCR | TRIzol试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| gDNA去除混合液 | Vazyme | -- | |
| HiScript QRT SuperMix（用于qPCR） | Vazyme | -- | |
| qRT-PCR | SYBR Green预混液 | Vazyme | -- |
| ABI PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | HyClone-Pierce | -- |
| RPL35A抗体 | Abcam | ab241070 | |
| MYC抗体 | CST | 5605 | |
| SKP2抗体 | PTG | 15010-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Bioworld | AP0063 | |
| PKM2抗体 | Bioss | bs-0102M | |
| HK2抗体 | Proteintech | 66974-1-Ig | |
| GLUT1抗体 | Bioss | bs-4855R | |
| ADH4抗体 | Abcam | ab137077 | |
| ALDOC抗体 | Proteintech | 14884-1-AP | |
| Histone H3抗体 | CST | 4499S | |
| 山羊抗兔二抗 | Beyotime | A0208 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | Beyotime | A0216 | |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Millipore | -- | |
| AI600成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| 免疫沉淀 | Protein A/G磁珠 | 文中未明确说明 | -- |
| 细胞增殖检测 | Celigo成像细胞仪 | Nexcelom Bioscience | -- |
| EdU染色 | Click-iT EdU HCS检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-APC检测试剂盒 | Yeasen Biotechnology | -- |
| Guava easyCyte流式细胞仪 | MilliporeSigma | -- | |
| Transwell迁移 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 倒置显微镜（Olympus IX73） | Olympus | IX73 | |
| 葡萄糖测定 | 葡萄糖检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| 乳酸测定 | 乳酸检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| ATP测定 | ATP检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| GloMax Discover酶标仪 | Promega | -- | |
| ECAR测定 | 细胞外酸化率检测试剂盒 | BestBio | -- |
| OCR测定 | 耗氧率检测试剂盒 | BestBio | -- |
| 微阵列分析 | 3' IVT Plus试剂盒 | Affymetrix | -- |
| Affymetrix Scanner 3000扫描仪 | Affymetrix | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | Opti-MEM培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| pRL-TK海肾荧光素酶质粒 | 文中未明确说明 | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | CST | 9003 |
| 抗MYC抗体 | Boster | BM4042 | |
| 正常兔IgG | CST | 2729 | |
| VirTis Virsonic 100超声破碎仪 | VirTis | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Cavens Beagle Model Animal Research Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | IHC染色评分标准、样本量（肺癌88例，癌旁77例） 阅读提示：见Methods部分'Immunohistochemistry'及Figure 1 |
| 细胞培养 | 细胞系（A549、NCI-H1299）、培养基（F-12）、血清浓度（10% FBS） 阅读提示：见Methods部分'Cell culture' |
| 基因敲低/过表达 | shRNA靶序列、慢病毒载体（BR-V108）、感染细胞系 阅读提示：见Methods部分'Lentivirus RNA interference constructs'及Figure S1 |
| 细胞功能检测 | CCK-8接种密度（1500-2500/孔）、EdU浓度（10μM）、划痕实验细胞密度（5×10^4/孔）、Transwell细胞数（100,000） 阅读提示：见Methods部分'Cell counting assay','EDU staining assay','Wound-healing assay','Transwell migration assay' |
| 代谢检测 | 葡萄糖、乳酸、ATP检测试剂盒（Solarbio）、ECAR/OCR检测试剂盒（BestBio）、细胞密度（5×10^5/孔） 阅读提示：见Methods部分'Measurements of glucose, lactic acid, and ATP levels'及'Measurement of ECAR and OCR' |
| 机制实验 | Co-IP抗体（RPL35A、MYC）、ChIP抗体（MYC）、双荧光素酶报告基因质粒（SKP2-WT/MUT） 阅读提示：见Methods部分'Co-immunoprecipitation','Chromatin immunoprecipitation (CHIP)','Firefly luciferase & Renilla luciferase assay' |
| 体内实验 | 动物品系（BALB/c裸鼠）、周龄（4周）、体重（16-18g）、细胞注射数（1×10^7）、分组（每组5只）、观察时间（30天） 阅读提示：见Methods部分'Xenograft transplantation in vivo' |