ELF5基因克隆与鉴定
从水牛乳腺组织中鉴定ELF5转录本并确定其编码序列。
从泌乳和非泌乳水牛乳腺组织提取RNA,RT-PCR扩增ELF5,克隆到pMD18-T载体并测序,鉴定出768 bp CDS,对应转录本ELF5_X2。
Deciphering the regulatory role of ELF5 in buffalo lactation.
包含基因克隆鉴定、生物信息学分析、组织表达谱、细胞亚定位实验、体外过表达/敲低功能研究、信号通路蛋白检测及代谢活性测定,具备多层级验证。
水牛乳腺上皮细胞(BuMECs) 泌乳期与非泌乳期Binglangjiang水牛组织样本
ELF5过表达载体(pEGFP-N1)转染BuMECs,效率88.4% siRNA敲低ELF5,效率85.6% 转染前用3 μg/mL催乳素处理48小时诱导泌乳 RT-qPCR检测信号通路及乳蛋白基因表达,Western blot验证蛋白水平
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
从水牛乳腺组织中鉴定ELF5转录本并确定其编码序列。
从泌乳和非泌乳水牛乳腺组织提取RNA,RT-PCR扩增ELF5,克隆到pMD18-T载体并测序,鉴定出768 bp CDS,对应转录本ELF5_X2。
预测ELF5蛋白结构、功能位点及与STAT5的相互作用。
使用多种工具预测二级、三级结构,保守结构域,翻译后修饰位点,并通过ZDOCK进行分子对接分析ELF5与STAT5A/B的相互作用。
分析ELF5在不同组织的表达差异及其在BuMECs中的亚细胞定位。
RT-qPCR检测8个组织中ELF5表达,用LSCM观察转染ELF5_EGFP的BuMECs,确定其定位于细胞核和细胞质。
研究ELF5对乳蛋白合成相关基因表达、酪蛋白浓度及细胞代谢活性的影响。
在BuMECs中转染ELF5_EGFP或siRNA,48小时后通过RT-qPCR检测信号通路和乳蛋白基因表达,ELISA测定酪蛋白浓度,Western blot检测通路蛋白表达。
评估ELF5对BuMECs增殖相关代谢活性的影响。
使用CCK-8试剂盒检测过表达和敲低ELF5后BuMECs的代谢活性,过表达显著增强活性,敲低则抑制。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取与反转录 | RNAiso Plus | TaKaRa | -- |
| M-MLV逆转录试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| 基因克隆 | 2×Es Taq预混液 | CWBIO | -- |
| pMD18-T载体 | TaKaRa | -- | |
| 细胞培养与处理 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素/两性霉素B | Gibco | -- | |
| 催乳素 | Sigma | -- | |
| 过表达载体构建 | pEGFP-N1载体 | CLONTECH Laboratories, Inc. | -- |
| 亚细胞定位 | MitoTracker® Red CMXRos | Solarbio | -- |
| DAPI | Solarbio | -- | |
| 酪蛋白检测 | 牛酪蛋白ELISA试剂盒 | Mlbio | -- |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Sangon Biotech | -- |
| 蛋白质提取 | 细胞裂解液 | Affinibody | -- |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| Western blot | PVDF膜(0.45 μm) | Millipore | -- |
| 兔抗JAK2抗体 | Nature Biosciences | A80717 | |
| 兔抗JAK2 (Y1007+Y1008) 抗体 | Nature Biosciences | A24101 | |
| 兔抗STAT5抗体 | Bioss | bs-1142R | |
| 兔抗磷酸化STAT5抗体 | Bioss | bs-5619R | |
| 兔抗PI3K抗体 | Bioss | bs-10657R | |
| 兔抗磷酸化PI3K抗体 | Bioss | bs-6417R | |
| 兔抗AKT1抗体 | Bioss | bs-0115R | |
| 兔抗磷酸化AKT1抗体 | Bioss | bs-10133R | |
| 兔抗mTOR抗体 | Nature Biosciences | A97175 | |
| 兔抗磷酸化mTOR (S2481) 抗体 | Nature Biosciences | A27561 | |
| 兔抗β-酪蛋白抗体 | Bioss | bs-0466R | |
| 小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体 | TransGen Biotech | HC201 | |
| 多克隆山羊抗兔IgG | Millipore | #2491145 | |
| 多克隆山羊抗小鼠IgG | Millipore | #2517746 | |
| 超敏ECL检测系统 | Sunview | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | Binglangjiang水牛,泌乳期(产后60天)和非泌乳期(产前60天),4岁,第三胎次 阅读提示:Materials and methods 2.1 样本采集 |
| 基因克隆 | PCR退火温度:56°C (ELF5_X1) 和58.5°C (ELF5_X2);连接到pMD18-T载体转化DH5α 阅读提示:Materials and methods 2.2 克隆与鉴定 |
| 细胞培养与处理 | BuMECs在DMEM/F12 + 10% FBS培养基中培养;转染前用3 μg/mL催乳素处理48小时诱导泌乳 阅读提示:Materials and methods 2.6 细胞培养与转染 |
| 转染与敲低 | 转染3 μg ELF5_EGFP或siRNA_ELF5;48小时后收获细胞 阅读提示:Materials and methods 2.6 细胞培养与转染 |
| 表达分析 | RT-qPCR以ACTB、GAPDH、RPS23为内参,结果用2-ΔΔCt法计算 阅读提示:Materials and methods 2.4 组织差异表达分析 |