PEDV和BVDV共感染通过TLR7依赖性机制激活NF-κB通路

PEDV and BVDV coinfection activates the NF-κB pathway by a TLR7-dependent mechanism.

作者信息Jinghua Cheng, Benqiang Li, Jie Tao, Ying Shi, Huili Liu
PMID41221396
发布时间2025-10-27
DOI10.3389/fmicb.2025.1684847

实验完整度

研究包含体外细胞实验,通过TCID50、qPCR、Western blot、IFA、siRNA敲低及药物抑制进行功能与机制验证,但缺乏动物模型或临床样本等独立证据层级。

主要模型

PK15细胞

重点核对

BVDV预感染6小时后再感染PEDV PEDV与BVDV共感染MOI均为1 TLR7 siRNA敲低(100 nmol)处理48小时 TLR7抑制剂HCQ(1 μM)预处理2小时 在12、24、36、48 hpi测定PEDV滴度

摘要

Introduction: In recent years, coinfections of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) with other enteric pathogens have been frequently observed in diarrheal piglets. However, the underlying mechanisms of pathogen-pathogen or pathogen-host interactions during such coinfections remain to be elucidated.Methods: In this study, an in vitro coinfection test of bovine viral diarrhea virus (BVDV) and PEDV was performed on model cells established before to explore the effect of coinfection on PEDV replication. Additionally, we used small interfering RNA (siRNA) assay to explore the role of TLRs related to NF-κB signaling in response to PEDV and BVDV coinfection.Results: We found that after preinfection with BVDV, PEDV replicates faster and more easily in PK15 cells. Further analysis revealed that coinfection of PEDV and BVDV significantly induced NF-κB activity, leading to increased translocation of the NF-κB p65 subunit from the cytoplasm to the nucleus. Moreover, TLR7 was identified as a key pattern recognition receptor in this process, mediating NF-κB activation and promoting the expression of inflammatory cytokines.Discussion: These results suggest that synergistic interactions between PEDV and BVDV during coinfection may strongly activate the host immune system and enhance virus replication. This study provides new insights into the immune modulation mechanisms underlying viral coinfections.

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
PEDV和BVDV共感染如何增强PEDV复制,以及NF-κB通路的激活是否由TLR介导及其具体机制。
核心机制
PEDV和BVDV共感染通过TLR7-MyD88信号通路激活NF-κB,促进p65核转位和炎性细胞因子表达,进而增强PEDV复制。
主要证据
共感染显著上调TLR7、MyD88、IRAK4和TRAF6表达,增加p65核转位;siTLR7敲低抑制IκBα降解、p65核转位及IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α表达,同时降低PEDV滴度。
研究意义
研究揭示了腹泻病毒共感染导致疾病严重化的免疫病理机制,为病毒共感染的分子发病机制提供了新见解。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

评估BVDV预感染对PEDV复制的影响

验证BVDV预感染是否促进PEDV在PK15细胞中的复制。

PK15细胞接种BVDV(0.01或1 MOI)6小时后感染PEDV(1 MOI),在12、24、36、48 hpi通过TCID50和qPCR检测PEDV滴度和N基因mRNA水平。

2

检测共感染对NF-κB p65核转位的影响

验证PEDV与BVDV共感染是否增强NF-κB活化。

PK15细胞以MOI 1感染PEDV或共感染BVDV,24小时后通过免疫荧光检测p65核转位。

3

检测共感染对TLR表达的影响

筛选参与共感染诱导NF-κB激活的TLR成员。

PK15细胞以MOI 1感染PEDV或共感染BVDV,在6、12、24 hpi通过qPCR和Western blot检测TLR3、TLR7、TLR8、TLR9表达,同时检测MyD88、IRAK4、TRAF6表达。

4

验证TLR7-MyD88信号介导NF-κB激活

验证TLR7信号通路是否介导共感染诱导的NF-κB激活和炎性细胞因子表达。

PK15细胞转染siTLR7或对照siRNA 48小时后共感染PEDV和BVDV,通过Western blot检测TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6、IκBα,IFA检测p65核转位,qPCR和ELISA检测IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α表达。

5

评估TLR7激活对病毒复制的影响

验证TLR7介导的炎症反应是否促进PEDV复制。

PK15细胞用TLR7抑制剂HCQ(1 μM)预处理2小时或转染siTLR7,然后共感染PEDV和BVDV,通过TCID50、Western blot和qPCR检测PEDV滴度、N蛋白和mRNA水平。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证免疫效应
验证机制链路

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基Gibco--
胎牛血清Gibco--
硫酸羟氯喹Selleck--
Toll样受体抗体试剂盒Cell Signaling Technology48697
p65抗体Cell Signaling Technology8242
Myd88抗体Cell Signaling Technology4283
IRAK4抗体Cell Signaling Technology4363
TRAF6抗体Cell Signaling Technology8028
β-肌动蛋白抗体Cell Signaling Technology3700
BVDV E2蛋白多克隆抗体Bioss Biotechnology--
PEDV N蛋白单克隆抗体BioNote--
胰蛋白酶Promega--
7500实时荧光定量PCR系统ABI--
TRIzol试剂Thermo Fisher Scientific--
SuperScript III逆转录试剂盒Thermo Fisher Scientific--
SYBR Premix Ex Taq IITaKaRa Bio--
猪ELISA试剂盒FineTest--
DAPI染料Beyotime Biotechnology--
荧光显微镜Carl Zeiss--
Lipofectamine 3000转染试剂Thermo Fisher Scientific--
Opti-MEM培养基Gibco--
小干扰RNAGene Pharma Co.--
RIPA裂解缓冲液Beyotime--
硝酸纤维素滤膜Millipore--
增强化学发光检测试剂盒Thermo Fisher Scientific--
Amersham Imager 600成像系统Cytiva Sweden AB--
ImageJ软件NIH--
GraphPad Prism 6软件GraphPad Software Inc.--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
病毒复制实验
BVDV预感染剂量(0.01或1 MOI),预感染时间(6小时),PEDV感染MOI(1),检测时间点(12、24、36、48 hpi)
阅读提示:材料与方法章节2.2,图1
NF-κB激活检测
感染MOI(1),处理时间(24小时),p65核转位定量方法
阅读提示:材料与方法章节2.3,图2
TLR7表达检测
感染MOI(1),检测时间点(6、12、24 hpi),TLR7抗体来源
阅读提示:材料与方法章节2.2和2.5,图3
TLR7敲低实验
siRNA浓度(100 nmol),转染时间(48小时),共感染MOI(1)和处理时间(24小时)
阅读提示:材料与方法章节2.4,图4
药物抑制实验
HCQ浓度(1 μM),预处理时间(2小时),共感染MOI(1),检测时间点(24、48 hpi)
阅读提示:材料与方法章节2.6,图5