评估BVDV预感染对PEDV复制的影响
验证BVDV预感染是否促进PEDV在PK15细胞中的复制。
PK15细胞接种BVDV(0.01或1 MOI)6小时后感染PEDV(1 MOI),在12、24、36、48 hpi通过TCID50和qPCR检测PEDV滴度和N基因mRNA水平。
PEDV and BVDV coinfection activates the NF-κB pathway by a TLR7-dependent mechanism.
研究包含体外细胞实验,通过TCID50、qPCR、Western blot、IFA、siRNA敲低及药物抑制进行功能与机制验证,但缺乏动物模型或临床样本等独立证据层级。
PK15细胞
BVDV预感染6小时后再感染PEDV PEDV与BVDV共感染MOI均为1 TLR7 siRNA敲低(100 nmol)处理48小时 TLR7抑制剂HCQ(1 μM)预处理2小时 在12、24、36、48 hpi测定PEDV滴度
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证BVDV预感染是否促进PEDV在PK15细胞中的复制。
PK15细胞接种BVDV(0.01或1 MOI)6小时后感染PEDV(1 MOI),在12、24、36、48 hpi通过TCID50和qPCR检测PEDV滴度和N基因mRNA水平。
验证PEDV与BVDV共感染是否增强NF-κB活化。
PK15细胞以MOI 1感染PEDV或共感染BVDV,24小时后通过免疫荧光检测p65核转位。
筛选参与共感染诱导NF-κB激活的TLR成员。
PK15细胞以MOI 1感染PEDV或共感染BVDV,在6、12、24 hpi通过qPCR和Western blot检测TLR3、TLR7、TLR8、TLR9表达,同时检测MyD88、IRAK4、TRAF6表达。
验证TLR7信号通路是否介导共感染诱导的NF-κB激活和炎性细胞因子表达。
PK15细胞转染siTLR7或对照siRNA 48小时后共感染PEDV和BVDV,通过Western blot检测TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6、IκBα,IFA检测p65核转位,qPCR和ELISA检测IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α表达。
验证TLR7介导的炎症反应是否促进PEDV复制。
PK15细胞用TLR7抑制剂HCQ(1 μM)预处理2小时或转染siTLR7,然后共感染PEDV和BVDV,通过TCID50、Western blot和qPCR检测PEDV滴度、N蛋白和mRNA水平。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 硫酸羟氯喹 | Selleck | -- |
| Western blot | Toll样受体抗体试剂盒 | Cell Signaling Technology | 48697 |
| p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| Myd88抗体 | Cell Signaling Technology | 4283 | |
| IRAK4抗体 | Cell Signaling Technology | 4363 | |
| TRAF6抗体 | Cell Signaling Technology | 8028 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 免疫荧光 | BVDV E2蛋白多克隆抗体 | Bioss Biotechnology | -- |
| PEDV N蛋白单克隆抗体 | BioNote | -- | |
| 病毒滴定 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| qPCR | 7500实时荧光定量PCR系统 | ABI | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 逆转录 | SuperScript III逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qPCR | SYBR Premix Ex Taq II | TaKaRa Bio | -- |
| ELISA | 猪ELISA试剂盒 | FineTest | -- |
| 免疫荧光 | DAPI染料 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 荧光显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| RNA干扰 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| 小干扰RNA | Gene Pharma Co. | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Beyotime | -- |
| 硝酸纤维素滤膜 | Millipore | -- | |
| 增强化学发光检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Amersham Imager 600成像系统 | Cytiva Sweden AB | -- | |
| 图像分析 | ImageJ软件 | NIH | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 6软件 | GraphPad Software Inc. | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒复制实验 | BVDV预感染剂量(0.01或1 MOI),预感染时间(6小时),PEDV感染MOI(1),检测时间点(12、24、36、48 hpi) 阅读提示:材料与方法章节2.2,图1 |
| NF-κB激活检测 | 感染MOI(1),处理时间(24小时),p65核转位定量方法 阅读提示:材料与方法章节2.3,图2 |
| TLR7表达检测 | 感染MOI(1),检测时间点(6、12、24 hpi),TLR7抗体来源 阅读提示:材料与方法章节2.2和2.5,图3 |
| TLR7敲低实验 | siRNA浓度(100 nmol),转染时间(48小时),共感染MOI(1)和处理时间(24小时) 阅读提示:材料与方法章节2.4,图4 |
| 药物抑制实验 | HCQ浓度(1 μM),预处理时间(2小时),共感染MOI(1),检测时间点(24、48 hpi) 阅读提示:材料与方法章节2.6,图5 |