验证NRIR在M1巨噬细胞极化中的表达和功能
检测NRIR在M1巨噬细胞中的表达，并探究其敲低对M1极化的影响。
用LPS/IFN-γ诱导THP-1分化为M1巨噬细胞，通过siRNA敲低NRIR，使用RT-qPCR、Western blot、流式细胞术和免疫荧光检测M1标志物（CD86, iNOS）及炎症因子（IL-1β, IL-6, CXCL10）的表达。
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LncRNA NRIR通过RSAD2/NF-κB轴促进巨噬细胞M1极化抑制种植体周围炎中的成骨作用
LncRNA NRIR inhibits osteogenesis by promoting macrophage M1 polarization through RSAD2/NF-κB axis in peri-implantitis.
实验完整度
高包含体外细胞实验（siRNA敲低、过表达、Western blot、RT-qPCR、流式、免疫荧光）、细胞共培养（BMSCs成骨分化）、体内大鼠种植体周围炎模型（micro-CT、IHC）等多个独立证据层级，并进行机制验证（NF-κB通路）。
主要模型
THP-1人单核细胞系诱导的M1巨噬细胞 人骨髓间充质干细胞（BMSCs） 大鼠种植体周围炎模型
重点核对
THP-1细胞用200 ng/ml PMA诱导24小时形成M0巨噬细胞，再用100 ng/ml LPS和20 ng/ml IFN-γ处理48小时诱导M1极化。 siRNA敲低NRIR和RSAD2，使用100 pmol siRNA和7.0 μl CALNPTM RNAi试剂A及2.0 μl试剂B转染。 BMSCs用NRIR敲低巨噬细胞上清与成骨诱导培养基1:1混合培养，ALP染色在14天，ARS染色在21天。 大鼠模型中，LPS组注射P. gingivalis来源LPS（1 mg/mL，每次10 μl，每3天一次，持续2周），SN组注射200 μl巨噬细胞上清（每3天一次，持续2周）。 Western blot检测磷酸化p65、IκB等蛋白，使用Diprovocim激活NF-κB信号验证机制。
摘要
Introduction: Peri-implantitis is an inflammatory condition affecting the hard and soft tissues surrounding osseointegrated implants, characterized by progressive alveolar bone destruction. The long non-coding RNA Negative Regulator of Interferon Response (lncRNA NRIR) is widely recognized as a biomarker for certain autoimmune diseases and participates in their pathogenesis. However, our previous studies revealed significant upregulation of NRIR in peri-implantitis, suggesting its potential role in peri-implantitis. In peri-implantitis lesions, there is often a substantial infiltration of M1 macrophages. Thus, this study investigated the regulatory role and underlying mechanisms of NRIR in macrophage polarization during peri-implantitis.Methods: Transcriptome sequencing analysis revealed radical S-adenosyl methionine domain containing 2 (RSAD2) as an NRIR-interacting mRNA in macrophages. Using siRNA gene knockdown technology, we suppressed NRIR and RSAD2 expression in M1 macrophages derived from THP-1 cells. Subsequently, we employed RT-qPCR, Western blot, flow cytometry, and immunofluorescence staining to assess the levels of inflammatory cytokines and M1 macrophage-associated markers, aiming to elucidate the involvement of NRIR/RSAD2/NF-κB axis in macrophage polarization. Supernatants from NRIR-knockdown macrophages were collected to prepare the culture medium for bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). The expression of osteogenic-related factors in BMSCs was evaluated through RT-qPCR, Western blot, Alkaline phosphatase (ALP) activity, and alizarin red S (ARS) staining. Furthermore, a rat peri-implantitis model was established, and the degree of peri-implant tissue inflammation and bone loss was assessed using micro-CT scanning and immunohistochemistry after treatment with various macrophage supernatants.Results: NRIR knockdown reduced RSAD2 expression and suppressed activation of the NF-κB pathway, consequently decreasing inflammatory cytokines and M1 macrophage-associated cytokine expression in THP-1 macrophages. Functionally, NRIR knockdown in macrophages promoted osteogenic differentiation of BMSCs. In vivo experiments showed that supernatants derived from NRIR-knockdown macrophages resulted in reduced inflammatory infiltration, diminished bone resorption, and increased expression of osteogenesis-related factors.Discussion: This study demonstrates that NRIR functions as a pro-inflammatory modulator in peri-implantitis by activating M1 macrophages through the RSAD2/NF-κB axis, providing novel insights into peri-implantitis pathogenesis that may inform future preventive and therapeutic strategies.
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究探讨lncRNA NRIR在种植体周围炎中对巨噬细胞极化的调控作用及其潜在机制。
- 核心机制
- NRIR通过上调RSAD2表达，激活NF-κB信号通路，促进M1巨噬细胞极化，进而抑制BMSCs成骨分化，加重种植体周围炎症和骨吸收。
- 主要证据
- 通过siRNA敲低NRIR或RSAD2，检测M1标志物和炎症因子表达；转录组测序和GSEA分析显示NF-κB通路下调；共培养实验显示NRIR敲低巨噬细胞上清促进BMSCs成骨分化；大鼠模型显示NRIR敲低巨噬细胞上清减轻炎症和骨吸收。
- 研究意义
- 揭示NRIR/RSAD2/NF-κB轴在种植体周围炎发病机制中的新作用，为种植体周围炎的预防和治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定NRIR调控M1极化的下游靶基因RSAD2
利用转录组测序和生物信息学分析确定NRIR的下游靶基因。
对NRIR敲低和对照M1巨噬细胞进行RNA-seq，通过PCA、差异表达分析、GSEA和韦恩图分析，结合先前预测的NRIR靶基因，确定RSAD2为潜在靶基因，并验证NRIR敲低后RSAD2表达的变化。
验证RSAD2在M1巨噬细胞极化中的作用
探究RSAD2敲低对M1巨噬细胞极化的影响。
使用siRNA敲低RSAD2，通过RT-qPCR、Western blot、流式细胞术和免疫荧光检测M1标志物和炎症因子的表达。
rescue实验验证NRIR通过RSAD2调控M1极化
确认NRIR敲低后过表达RSAD2能否逆转M1极化的抑制。
在NRIR敲低的THP-1巨噬细胞中转入RSAD2过表达质粒，通过RT-qPCR和Western blot检测M1标志物和RSAD2的表达。
验证NRIR通过RSAD2调控NF-κB信号通路
检测NRIR和RSAD2调控M1极化是否依赖NF-κB信号通路。
通过Western blot检测NRIR敲低或RSAD2敲低后磷酸化p65、IκB等蛋白水平，并使用TLR1/TLR2激动剂Diprovocim处理，观察NF-κB通路激活的恢复。
评估NRIR敲低巨噬细胞上清对BMSCs成骨分化的影响
探究NRIR敲低巨噬细胞分泌因子对BMSCs成骨分化的影响。
收集NRIR敲低M1巨噬细胞上清，与成骨诱导培养基共培养BMSCs，通过RT-qPCR、Western blot检测成骨标志物（OCN, OPN, RUNX2）表达，并通过ALP和ARS染色评估成骨分化。
体内实验验证NRIR敲低巨噬细胞上清对种植体周围炎的影响
评估NRIR敲低巨噬细胞上清对大鼠种植体周围炎模型炎症和骨吸收的影响。
建立大鼠种植体周围炎模型，分别注射对照上清或NRIR敲低上清，通过临床观察、micro-CT和免疫组化评估炎症浸润、骨丢失和成骨标志物表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Procell | -- |
| 胎牛血清 | PAN | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime | -- | |
| PMA（佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯） | Sigma | -- | |
| 脂多糖 | -- | -- | |
| 干扰素-γ | -- | -- | |
| α-MEM培养基 | Procell | -- | |
| CO2培养箱 | Esco | -- | |
| 细胞转染 | Opti-MEMI减血清培养基 | Gibco | 31985-070 |
| CALNPTM RNAi试剂A | D-Nano | -- | |
| CALNPTM RNAi试剂B | D-Nano | -- | |
| Lipofect5000试剂 | BIOG | -- | |
| 转染缓冲液 | BIOG | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Sangon | -- |
| RT-qPCR | SteadyPure快速RNA提取试剂盒 | Accurate Biology | -- |
| Evo M-MLV反转录Mix试剂盒 | Accurate Biology | -- | |
| SYBR® Green Premix Pro Taq HS RT-qPCR试剂盒 | Accurate biology | -- | |
| Western blot | 总蛋白提取试剂盒 | Keygen Biotech | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗RSAD2抗体 | Proteintech | 28089-1-AP | |
| 抗CD86抗体 | Huabio | ET1606-50 | |
| 抗iNOS抗体 | Huabio | HA722031 | |
| 抗磷酸化p65抗体 | CST | 3033T | |
| 抗p65抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| 抗磷酸化IκB抗体 | Huabio | HA722770 | |
| 抗IκB抗体 | Huabio | ET1603-6 | |
| 抗OPN抗体 | Proteintech | 80912-4-RR | |
| 抗OCN抗体 | Bioss | bs-4917R | |
| 抗RUNX2抗体 | Huabio | ET1612-47 | |
| 抗GAPDH抗体 | Affinity | AF7021 | |
| HRP标记二抗 | Proteintech | SA00001-2 | |
| 增强化学发光试剂 | Affinity | -- | |
| iBright CL1000成像系统 | Thermo | -- | |
| 流式细胞术 | 人Fc受体阻断液 | BioLegend | 422301 |
| PE标记抗CD86抗体 | Biolegend | 374205 | |
| FACSMelody流式细胞仪 | BD | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 山羊血清 | -- | -- | |
| DAPI | Solarbio | -- | |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | OXFORD | -- | |
| 成骨分化检测 | 成骨诱导培养基 | Oricell | -- |
| ALP染色试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 茜素红S染色液 | Oricell | -- | |
| 体视显微镜 | SOPTOP | -- | |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| Ti-6AL-4V螺钉型种植体 | -- | -- | |
| 牙龈卟啉单胞菌脂多糖 | -- | -- | |
| 微型CT | Siemens | -- | |
| DAB显色液 | -- | -- | |
| 奥林巴斯BX51显微镜 | Olympus | -- | |
| NF-κB通路验证 | Diprovocim | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| THP-1细胞培养与M1极化 | THP-1细胞用200 ng/ml PMA刺激24小时形成M0，再用100 ng/ml LPS和20 ng/ml IFN-γ处理48小时诱导M1极化。 阅读提示：参见Materials and Methods 2.1 |
| siRNA敲低 | siRNA序列和浓度（100 pmol），转染试剂用量（CALNPTM RNAi试剂A 7.0 μl，B 2.0 μl）。 阅读提示：参见Materials and Methods 2.2和补充表S1 |
| BMSCs成骨分化 | BMSCs来源和培养条件（α-MEM培养基），成骨诱导时间（ALP 14天，ARS 21天），上清与成骨诱导培养基比例（1:1）。 阅读提示：参见Materials and Methods 2.9 |
| 大鼠种植体周围炎模型 | 大鼠品系、性别、周龄（SD，雄性，8周龄），种植体尺寸（2mm直径，3mm螺纹长度），LPS注射剂量（10 μl, 1 mg/ml），上清注射剂量（200 μl），注射频率（每3天，持续2周）。 阅读提示：参见Materials and Methods 2.10 |
| micro-CT分析 | 扫描参数（spot size 50 µm, tube voltage 80 kVp, tube current 500 µA），骨丢失测量位置（distal, mesial, buccal, palatal）。 阅读提示：参见Materials and Methods 2.11 |