Lama2基因敲除小鼠的构建
构建基于人类LAMA2-MD高频突变区域的Lama2基因敲除小鼠模型
利用CRISPR-Cas9技术，通过靶向Lama2基因外显子3的sgRNA和Cas9 mRNA共注射到C57BL/6受精卵中，获得杂合子F0 founder，与C57BL/6小鼠回交产生F1代，F1杂合子互交产生F2代，并通过PCR和测序进行基因型鉴定。
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LAMA2相关肌营养不良症的新型小鼠模型及分子发病机制与临床表型分析
A novel mouse model for LAMA2-related muscular dystrophy with analysis of molecular pathogenesis and clinical phenotype.
实验完整度
中包含小鼠模型构建、表型分析、组织病理、scRNA-seq、bulk RNA-seq、western blot和免疫荧光等实验，但缺乏功能验证实验（如BBB渗漏实验），且部分实验样本量少。
主要模型
dyH/dyH小鼠（Lama2基因外显子3敲除） C57BL/6小鼠（野生型对照）
重点核对
Lama2基因外显子3的靶向删除（CRISPR-Cas9） dyH/dyH小鼠的生存期（中位生存期21天） dyH/dyH小鼠体重的显著降低 dyH/dyH小鼠血清CK水平的显著升高 dyH/dyH小鼠肌肉中laminin α2蛋白的完全缺失
摘要
我们对LAMA2相关肌营养不良症（LAMA2-MD）的分子发病机制的理解仍需提高。在此，我们报告了一种新的Lama2敲除小鼠（dyH/dyH）的表型、神经病理学和转录组学数据（scRNA-seq和bulk RNA-seq），该小鼠是基于人类LAMA2-MD突变热点区域利用CRISPR-Cas9技术创建的。dyH/dyH小鼠表现出严重的肌营养不良表型。小鼠脑scRNA-seq显示，在野生型小鼠中，Lama2基因主要在血管和软脑膜成纤维细胞以及血管平滑肌细胞中表达，在星形胶质细胞中弱表达。通过免疫荧光观察到层粘连蛋白α2在皮层表面的表达。在dyH/dyH小鼠中，这些细胞类型中的Lama2表达降低，这可能与胶质血管基底层组装破坏有关。此外，肌肉转录组分析显示有2020个差异表达基因，主要与肌肉细胞骨架和发育受损相关。总之，本研究为理解LAMA2-MD的分子发病机制提供了潜在有用的信息。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LAMA2-MD的分子发病机制尚不完全清楚，本研究旨在利用基于人类高频突变区域构建的新型Lama2敲除小鼠模型，探讨其表型、肌肉和脑的病理及转录组变化。
- 核心机制
- Lama2基因敲除导致laminin α2蛋白缺失，可能引起胶质血管基底层组装破坏，进而影响血脑屏障的完整性；在肌肉中，laminin α2缺乏导致肌营养不良，可能通过异常的整合素信号传导介导。
- 主要证据
- dyH/dyH小鼠表现出严重的肌营养不良表型；scRNA-seq显示Lama2在血管和软脑膜成纤维细胞、血管平滑肌细胞中高表达，其缺失与胶质血管基底层破坏相关；bulk RNA-seq发现2020个差异表达基因，主要涉及肌肉细胞骨架和发育。
- 研究意义
- 本研究为理解LAMA2-MD的分子发病机制提供了新的动物模型和转录组数据，可能为开发有效的治疗策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
dyH/dyH小鼠表型分析
评估dyH/dyH小鼠的一般表型，包括体重、生存期、运动功能和血清CK水平
记录WT、Het和dyH/dyH小鼠的外观、体重、生存期和运动功能（握力测试、跑台实验），并检测血清CK水平、进行肌肉MRI和肌肉组织病理学分析。
肌肉病理学和laminin α2蛋白检测
评估dyH/dyH小鼠的肌肉病理变化和laminin α2蛋白的表达
对P1、P4、P7、P14、P21的biceps femoris肌肉以及P14的其他肌肉进行H&E和Sirius Red染色，并通过Western blot和免疫荧光检测laminin α2蛋白的表达。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）
分析dyH/dyH和WT小鼠大脑的细胞类型特异性转录组变化
对P14小鼠大脑进行scRNA-seq，分析细胞分群、Lama2表达、差异表达基因和细胞间通讯。
bulk RNA测序（bulk RNA-seq）
分析dyH/dyH和WT小鼠肌肉组织的转录组差异
对P14小鼠的biceps femoris肌肉进行bulk RNA-seq，分析差异表达基因、GO和KEGG通路富集。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因编辑 | pCS-4G载体 | -- | -- |
| 基因型鉴定 | 逆转录系统 | Promega | A3500 |
| scRNA-seq | Chromium单细胞3'试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 肌肉组织包埋 | OCT包埋剂 | Tissue Tek | -- |
| 免疫荧光 | 抗层粘连蛋白α2链抗体 | Sigma | 4H8-2 |
| 抗层粘连蛋白α1链抗体 | R&D Systems | MAB4656 | |
| 抗MYOD1抗体 | Abcam | ab16148 | |
| 抗肌细胞生成素抗体 | R&D Systems | MAB66861 | |
| 抗MYF5抗体 | R&D Systems | MAB4027 | |
| 抗肌球蛋白重链抗体 | R&D Systems | MAB4470 | |
| 抗结蛋白抗体 | Invitrogen | MA5-15306 | |
| 抗CD68抗体 | Boster | BA3638 | |
| 抗α-肌营养不良蛋白聚糖抗体 | Merck Millipore | 05-593 | |
| 显微镜 | 徕卡显微镜 | Leica | DFC295 |
| 共聚焦显微镜 | 共聚焦显微镜 | Olympus | FV3000 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Plygen | -- |
| BCA蛋白测定 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 86298 | |
| 抗MYH2抗体 | Abcam | ab124937 | |
| 抗α-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 23660-I-AP | |
| 抗F-肌动蛋白抗体 | Bioss | bs-1571R | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 握力测试 | 握力计 | Shanghai XinRuan Information Technology Co., Ltd. | -- |
| 血清CK检测 | 小鼠CK ELISA试剂盒 | Nanjing Herb-Source Bio-Technology Co., Ltd | czy24506 |
| 肌肉MRI | 西门子TIM Trio 3.0T磁共振扫描仪 | Siemens | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | Lama2基因外显子3的靶向删除策略，CRISPR-Cas9载体和sgRNA序列，显微注射的具体操作，F0 founder的筛选 阅读提示：Materials and methods: Generation of a novel dyH/dyH knockout mouse with ΔExon 3 at Lama2 locus |
| 表型分析 | 小鼠品系、年龄（P7-P24）、样本量（WT、Het、dyH/dyH的数量）、体重、生存期、握力、跑台电击次数、血清CK水平 阅读提示：Figure 2 and Figure 2—figure supplement 1, Materials and methods: Four limbs grip strength test, Treadmill exercise protocol, Determination of the serum CK levels |
| 肌肉MRI | MRI扫描参数（T1W和T2W）、麻醉方法（5%水合氯醛，7 mL/kg）、小鼠年龄（P14和P21）、肌肉区域（骨盆和下肢）、样本量（每组4只） 阅读提示：Materials and methods: Muscle MR acquisition, Figure 2B |
| 肌肉组织病理和免疫荧光 | 肌肉类型（biceps femoris等）、时间点（P1、P4、P7、P14、P21）、组织包埋方法（OCT，液氮速冻）、切片厚度（7 μm）、染色方法（H&E、Sirius Red）、抗体信息（克隆号、稀释度） 阅读提示：Materials and methods: Muscle pathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry, Figure 3, Figure 4 |
| Western blot | 蛋白提取方法（RIPA）、抗体列表（靶标、克隆号、稀释度）、内参蛋白（GAPDH或β-tubulin）、样本量（WT和dyH/dyH各6，但laminin α2检测为3） 阅读提示：Materials and methods: Western blot analysis, Figure 4B, Figure 8B |
| scRNA-seq | 样本量（每组1个脑？）、P21小鼠的脑组织、10x Genomics平台、数据分析流程（CellRanger, Seurat）、差异表达基因和通路分析（clusterProfiler, CellChat） 阅读提示：Materials and methods: Single-cell RNA sequencing and data process, Figure 5 |
| bulk RNA-seq | 样本量（WT n=4, Het n=6, dyH/dyH n=6）、P14小鼠的biceps femoris肌肉、RNA提取（TRIzol）、测序平台（Illumina HiSeq X-Ten）、差异表达基因方法（DESeq2） 阅读提示：Materials and methods: RNA isolation and RNA sequencing, Figure 7 |