基于结构的虚拟筛选鉴定PPARγ配体
从天然化合物库中筛选可能靶向PPARγ的候选化合物。
使用PPARγ晶体结构（PDB ID: 1ZGY）对HY-L021天然产物库中的4531个化合物进行虚拟筛选，根据对接分数选出前19个化合物，并通过SPR验证结合亲和力，最终选出STA进行多浓度SPR分析。
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基于结构和生物学验证的水苏糖作为PPARγ调节配体治疗非酒精性脂肪性肝病的筛选研究
Screening Based on Structural and Biological Verification of Stachyose as a PPARγ-Modulating Ligand for the Treatment of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease.
实验完整度
高结合体外细胞模型（HepG2）、体内高脂饮食小鼠模型、SPR、分子对接、分子动力学模拟及Co-IP等机制验证，多层级实验证据支持结论。
主要模型
HepG2细胞 高脂饮食诱导的C57BL/6小鼠NAFLD模型
重点核对
STA和ROSI的给药剂量：STA 300和600 mg/kg，ROSI 5 mg/kg，每日灌胃 小鼠模型：8周龄雄性C57BL/6小鼠，高脂饮食（D12492）喂养24周 体外模型：HepG2细胞用0.4 mM OA和2 μg/mL LPS处理48小时 STA处理浓度：0.8和1.6 mg/mL PPARγ关键结合残基：GLU259, GLY284, PHE287, ILE341, LEU270
摘要
本研究鉴定水苏糖（STA），一种天然寡糖，作为新型部分PPARγ激动剂，在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中具有优于罗格列酮的治疗效果。STA通过SIRT1介导的去乙酰化独特地稳定PPARγ，同时避免Ser273磷酸化，从而增强脂肪酸氧化和抑制脂质生成，且无脱靶效应。这些发现确立了STA作为有前景的PPARγ靶向NAFLD治疗候选药物，为开发更安全的代谢调节剂提供了机制蓝图。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 水苏糖（STA）是否通过调节PPARγ信号通路改善非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）及其作用机制如何？
- 核心机制
- STA作为PPARγ部分激动剂，直接结合PPARγ，通过SIRT1介导的去乙酰化稳定PPARγ，而不影响Ser273磷酸化，从而增强脂肪酸氧化、抑制脂质生成，改善肝脏脂质积累、炎症和胰岛素抵抗。
- 主要证据
- 基于结构虚拟筛选和SPR实验验证STA与PPARγ结合；体外HepG2细胞和体内高脂饮食小鼠模型中，STA改善脂质代谢、炎症和胰岛素抵抗，效果优于ROSI；Co-IP实验证明STA促进PPARγ去乙酰化，依赖于SIRT1。
- 研究意义
- STA作为第二代PPARγ调节剂原型，通过配体结合选择性和表观遗传调控相结合，为开发更安全有效的NAFLD治疗策略提供了机制蓝图。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
网络药理学分析STA治疗NAFLD的潜力
预测STA的靶点并评估其与NAFLD的关联及潜在机制。
从GeneCards、OMIM、TTD和PHARMGKB数据库获取NAFLD相关靶点，使用SwissTargetPrediction预测STA靶点，取交集后进行GO和KEGG富集分析。
体外验证STA对肝细胞脂质沉积、炎症和胰岛素抵抗的影响
评估STA在细胞水平对NAFLD相关指标的作用，并与ROSI比较。
HepG2细胞用OA和LPS诱导脂质沉积模型，给予STA（0.8和1.6 mg/mL）或ROSI处理，检测TG含量、ORO染色、脂质代谢、炎症和胰岛素抵抗相关基因及蛋白表达。
体内验证STA对高脂饮食诱导小鼠NAFLD的保护作用
评估STA在动物模型中的疗效，并验证体外结果。
8周龄C57BL/6小鼠高脂饮食诱导NAFLD，STA（300或600 mg/kg）或ROSI（5 mg/kg）每日灌胃，检测肝组织病理（H&E、ORO、Bodipy染色）、脂质代谢、炎症、胰岛素抵抗相关基因和蛋白表达及空腹血糖。
分子动力学模拟和突变分析确认STA与PPARγ的结合稳定性及关键残基
研究STA与PPARγ的结合模式、动态稳定性和关键作用位点。
进行200ns分子动力学模拟，分析RMSD、Rg、RMSF、氢键频率、自由能景观和PCA；通过丙氨酸扫描突变分析确定关键残基。
验证STA对PPARγ翻译后修饰的影响及SIRT1的作用
阐明STA改善NAFLD的分子机制，特别是通过调节PPARγ乙酰化。
Western blot检测PPARγ Ser273磷酸化和SIRT1表达；Co-IP分析PPARγ乙酰化水平及SIRT1相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| HepG2细胞系 | Pricella | CL-0103 | |
| 药物处理 | 水苏糖 | MedChemExpress | -- |
| 罗格列酮 | MedChemExpress | -- | |
| 油酸 | Sigma | O1008 | |
| 脂多糖 | Sigma | LPS25 | |
| 细胞染色 | 油红O | Solarbio | G1262 |
| RNA提取与qRT-PCR | Trizol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa | RR037A | |
| SYBR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820A | |
| qRT-PCR | Applied Biosystems 7500 Fast实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| 生化指标检测 | 甘油三酯比色法试剂盒 | -- | -- |
| 葡萄糖检测试剂盒 | BioVision | K606-100 | |
| AST活性检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK055 | |
| ALT活性检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK052 | |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Abcam | 10010303 | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 |
| 抗乙酰辅酶A羧化酶抗体 | ABclonal | A15606 | |
| 抗TNFα抗体 | ABclonal | A11534 | |
| 抗IRS2抗体 | ABclonal | A7945 | |
| 抗乙酰赖氨酸抗体 | Abcam | ab22550 | |
| 抗乙酰赖氨酸抗体 | Abcam | ab190479 | |
| 抗SIRT1抗体 | Abcam | ab189494 | |
| 抗SIRT1抗体 | Abcam | ab110304 | |
| 抗GAPDH抗体 | ABclonal | A19056 | |
| 抗PPARγ抗体 | Abcam | ab316981 | |
| 抗PPARγ抗体 | Abcam | ab41928 | |
| 抗磷酸化Ser273 PPARγ抗体 | Bioss | bs4888R | |
| SPR分析 | CM5芯片 | -- | -- |
| 动物实验 | 高脂饮食 | Research Diets | D12492 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型建立 | HepG2细胞系来源、培养条件（DMEM+10%FBS+1%P/S）、诱导条件（0.4 mM OA和2 μg/mL LPS处理48小时）、STA处理浓度（0.8和1.6 mg/mL） 阅读提示：Materials and Methods 2.2, 2.3 |
| 动物模型建立 | 小鼠品系（C57BL/6，8周龄雄性）、高脂饮食（D12492）喂养24周、STA剂量（300和600 mg/kg）、ROSI剂量（5 mg/kg）、给药方式（每日灌胃）、对照组处理、动物伦理批准 阅读提示：Materials and Methods 2.3 |
| 生化指标检测 | 细胞TG检测（6孔板密度1×10^6）、血清制备（禁食6小时，采血后3000rpm离心10min）、肝脏TG检测（取50-100mg肝组织）、试剂盒品牌和货号 阅读提示：Materials and Methods 2.10 |
| 分子交互作用验证 | SPR实验条件（CM5芯片、蛋白质偶联、5% DMSO、流速30μL/min、接触时间150s、再生条件）、分子动力学模拟参数（200ns，Gromacs）、丙氨酸扫描分析软件（Discovery Studio 2021） 阅读提示：Materials and Methods 2.13, 2.15, 2.16 |
| 翻译后修饰分析 | Co-IP实验条件（抗体：抗乙酰赖氨酸、抗SIRT1、抗PPARγ）、WB检测蛋白（SIRT1、pSer273 PPARγ、乙酰化PPARγ） 阅读提示：Materials and Methods 2.17, Results 3.6 |