建立植入物相关金黄色葡萄球菌骨髓炎小鼠模型
模拟临床骨髓炎感染环境，研究脓肿形成和纤维化过程
在C57BL/6背景小鼠股骨第三转子处制造单皮质缺损，注入3 µL S. aureus悬液（2×10⁵ CFU/mL）或PBS，并植入无菌自攻钢螺钉。术后每日腹腔注射庆大霉素（20 mg/kg）。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
巨噬细胞来源的双调蛋白诱导骨髓金黄色葡萄球菌脓肿附近脂肪生成谱系前体细胞的肌成纤维细胞转化
Macrophage-derived amphiregulin induces myofibroblast transition in adipogenic lineage precursors near Staphylococcus aureus abscess in bone marrow.
实验完整度
高包含多种转基因小鼠模型（AdipoqCre-iDTR、Lyz2Cre-Aregf/f、AdipoqCre-Egfrf/f等），结合细胞实验、免疫荧光、CFU、微CT等多层级验证，并明确功能与机制验证。
主要模型
小鼠植入物相关金黄色葡萄球菌骨髓炎模型 Adipoq+骨髓脂肪生成前体细胞 3T3-L1前脂肪细胞系
重点核对
S. aureus菌株（临床分离株及ATCC 25923）及感染剂量2×10⁵ CFU/mL，3 µL注入股骨髓腔 AdipoqCre-iDTR小鼠白喉毒素（50 µg/kg）处理方案 巨噬细胞条件培养基制备条件（MOI=10，S. aureus处理1小时） AREG处理浓度100 ng/mL及处理时间48小时 rapamycin给药剂量4 mg/kg及给药频率
摘要
金黄色葡萄球菌（S. aureus）脓肿的形成是持续性骨骼感染的公认决定因素，但其细菌持续存在的机制仍不清楚。在此，我们证明骨髓脂联素阳性（Adipoq+）前体细胞被动员到金黄色葡萄球菌脓肿周围并经历肌成纤维细胞分化。这种表型转变诱导血管收缩，从而损害局部灌注并阻碍有效的细菌清除。机制上，巨噬细胞来源的双调蛋白（AREG）激活Adipoq+细胞上的EGFR信号，触发mTOR/YAP通路驱动其肌成纤维细胞转化。重要的是，Adipoq+细胞的基因消融、AREG/EGFR轴细胞特异性缺失或EGFR/mTOR信号的药理抑制可有效减轻纤维化，恢复血管灌注和抗生素递送，并促进脓肿中细菌的根除。我们的发现提示巨噬细胞-Adipoq+细胞调控轴维持骨髓炎中金黄色葡萄球菌的持续存在，并确定靶向该轴作为增强抗生素对金黄色葡萄球菌骨骼感染疗效的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 金黄色葡萄球菌骨髓炎中脓肿周围纤维化如何形成并影响抗生素疗效，其潜在机制是什么？
- 核心机制
- 巨噬细胞来源的AREG通过EGFR/mTOR/YAP通路诱导Adipoq+前体细胞向肌成纤维细胞转化，导致血管收缩、灌注受损和抗生素渗透受阻。
- 主要证据
- 通过AdipoqCre-iDTR小鼠消融Adipoq+细胞显著减少肌成纤维细胞，改善血管灌注和细菌清除；Lyz2Cre-Aregf/f和AdipoqCre-Egfrf/f小鼠敲除AREG/EGFR轴也显著抑制肌成纤维细胞转化并增强细菌清除；通路抑制剂验证了mTOR/YAP的关键作用。
- 研究意义
- 靶向AREG/EGFR/mTOR/YAP轴可能增强抗生素对金黄色葡萄球菌骨骼感染的疗效，为骨髓炎治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估感染后骨髓血流灌注及纤维化
验证S. aureus感染是否导致血管压缩和纤维化形成
通过尾静脉注射荧光素标记的凝集素评估血管灌注，使用Cdh5Cre-tdTomato小鼠追踪血管；Masson三色染色和免疫荧光检测α-SMA、Col-I表达。
验证Adipoq+细胞向肌成纤维细胞转化及其功能
确定Adipoq+细胞在脓肿周围纤维化中的作用
使用AdipoqCre-tdTomato追踪Adipoq+细胞，检测α-SMA和Col-I共定位；在AdipoqCre-iDTR小鼠中用DT消融Adipoq+细胞，评估肌成纤维细胞减少、血管灌注改善和细菌负荷下降。
筛选并验证巨噬细胞来源的AREG作为关键因子
鉴定巨噬细胞分泌的因子中哪种能诱导前脂肪细胞肌成纤维细胞转化
通过对比S. aureus处理的BMDM条件培养基对3T3-L1和原代BMpreA的影响，结合转录组数据和ELISA，筛选出AREG；进一步用Lyz2Cre-Aregf/f和Cx3cr1Cre-Aregf/f小鼠敲除Areg验证。
验证EGFR和mTOR/YAP通路在肌成纤维细胞转化中的作用
阐明AREG诱导Adipoq+细胞转化的下游信号通路
使用EGFR抑制剂gefitinib、mTOR抑制剂rapamycin等筛选通路；检测AREG处理后的p-EGFR、p-mTOR水平；通过western blot和免疫荧光评估YAP核转位。
评估体内基因敲除或药物抑制的治疗效果
验证靶向该轴能否减轻骨髓炎严重程度并增强细菌清除
在AdipoqCre-Egfrf/f小鼠或rapamycin处理的小鼠中检测肌成纤维细胞减少、血管灌注改善、FITC-庆大霉素渗透增加、细菌负荷降低及骨结构改善。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | 三溴乙醇 | 文中未明确说明 | -- |
| 庆大霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| 细胞消融 | 白喉毒素 | Aladdin | D381867 |
| 药物处理 | 雷帕霉素 | Selleck | S1039 |
| 吉非替尼 | YEASEN | 52717ES60 | |
| 血管灌注 | 荧光素标记的凝集素 | Vector Laboratories | FL-1171 |
| 免疫荧光 | 抗Endomucin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 |
| 抗αSMA抗体 | CST | 19245 | |
| 抗Col-I抗体 | Abcam | ab260043 | |
| 抗F4/80抗体 | Bio-Rad | MCA497 | |
| 抗AREG抗体 | Santa Cruz | sc-74501 | |
| 抗YAP抗体 | CST | 14074 | |
| 抗脂联素抗体 | Proteintech | 66239-1-Ig | |
| 抗p-mTOR抗体 | CST | 5536 | |
| 抗围脂滴蛋白抗体 | CST | 9349 | |
| 抗EGFR抗体 | CST | 4267 | |
| 组织学 | Masson三色染色试剂盒 | Solarbio | G1346 |
| 流式细胞术 | Zombie Aqua染料 | BioLegend | 423101 |
| 抗小鼠CD16/32抗体 | BioLegend | 101319 | |
| FITC抗小鼠CD11b | BioLegend | 101205 | |
| APC/Fire 750抗小鼠F4/80 | BioLegend | 123151 | |
| PerCP/Cyanine5.5抗小鼠Ly6G | BioLegend | 127616 | |
| APC/Cyanine7抗小鼠Ly6C | BioLegend | 128025 | |
| 抗小鼠CD11c PE | eBioscience | 12-0114-81 | |
| PerCP/Cyanine5.5抗小鼠MHCII | BioLegend | 107625 | |
| FITC抗小鼠CD3 | Biolegend | 100203 | |
| PE抗小鼠CD4 | Biolegend | 100407 | |
| APC抗小鼠CD8a | Biolegend | 100711 | |
| BV421抗小鼠CD86 | Biolegend | 105031 | |
| PerCP抗小鼠CD19 | Biolegend | 115531 | |
| 双调蛋白抗体Alexa Fluor 647 | Santa Cruz | SC-74501 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | GIBCO | -- |
| αMEM培养基 | GIBCO | -- | |
| 胎牛血清 | ThermoFisher | 10091148 | |
| 成脂培养基 | Cyagen | MUXMX-90031 | |
| 重组双调蛋白 | Peprotech | 315-36 | |
| 重组肝素结合EGF样生长因子 | Glpbio | GP20274 | |
| 吉非替尼 | YEASEN | 52717ES60 | |
| 雷帕霉素 | Selleck | S1039 | |
| PD0325901 | Selleck | S1036 | |
| SCH772984 | Selleck | S7101 | |
| 鲁索利替尼 | Selleck | S1378 | |
| Stattic | MedChemExpress | HY-13818 | |
| AZD5363 | Selleck | S8019 | |
| EVP4593 | Apexbio | A4217 | |
| 维替泊芬 | MedChemExpress | HY-B0146 | |
| 细菌感染 | 溶葡萄球菌素 | Bioss | D10379 |
| 庆大霉素 | Sigma | E003632 | |
| 细胞松弛素D | YEASEN | 53215ES03 | |
| RT-qPCR | RNAiso PLUS试剂 | Takara | 9109 |
| Evo M-MLV逆转录预混试剂盒 | Accurate Biology | AG11706 | |
| SYBR Green预混Pro Taq HS qPCR试剂盒 | Accurate Biology | AG11701 | |
| ELISA | 小鼠AREG ELISA试剂盒 | Biorbyt | orb774868 |
| 小鼠HBEGF ELISA试剂盒 | Biorbyt | orb775164 | |
| 蛋白提取 | 核浆蛋白提取试剂盒 | Beyotime | P0027 |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010 |
| p-EGFR抗体 | HuaBio | ET1606-44 | |
| EGFR抗体 | HuaBio | ET1604-44 | |
| p-mTOR抗体 | Proteintech | 67778-1-lg | |
| mTOR抗体 | Proteintech | 66888-1-lg | |
| p-YAP抗体 | CST | 13008 | |
| Lamin B1抗体 | Proteintech | 66095-1-Ig | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 成像设备 | 蔡司LSM980激光共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| Phenom Pharos G2扫描电子显微镜 | Phenom World | -- | |
| Micro-CT | SkyScan1276微型CT | Bruker | -- |
| 流式分析 | Beckman CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| RT-qPCR | QuantStudio 5系统 | Applied Biosystems | -- |
| ELISA | SpectraMax i3x酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| Western blot | BLT GelView 6000 Pro化学发光成像系统 | Biolight Biotechnology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系及周龄（10-12周）；S. aureus菌株及剂量（临床分离株或ATCC 25923，2×10⁵ CFU/mL，3 µL）；手术植入螺丝规格；术后庆大霉素处理（20 mg/kg/天） 阅读提示：Methods: Mouse models and treatments |
| 细胞消融实验 | AdipoqCre-iDTR小鼠DT给药方案（剂量50 µg/kg，术前连续2天，术后隔天持续2周） 阅读提示：Methods: Mouse models and treatments, Figure legends 2D-F |
| 细胞培养及处理 | 3T3-L1和BMpreA的培养条件；AREG浓度（100 ng/mL）及处理时间（48小时）；抑制剂浓度（gefitinib 5 μM, rapamycin 1 μM等） 阅读提示：Methods: Cell culture, Figure legend 3B, 6A-E |
| 条件培养基制备 | BMDM感染条件（MOI=10, 1小时），细胞外细菌清除（lysostaphin 20 µg/mL, gentamicin 50 µg/mL, 1小时），培养24小时后收集上清 阅读提示：Methods: Preparation of macrophage-derived conditioned medium |
| 血管灌注检测 | 荧光素标记的凝集素浓度（0.75 mg/mL, 100 µL, 尾静脉注射，2分钟注射，8分钟后取材） 阅读提示：Methods: Vessel perfusion assays |
| 细菌负荷测定 | femur匀浆稀释至10⁻⁴，TSA平板培养16小时；植入物超声处理（40 kHz, 300 W, 10分钟）后稀释100倍 阅读提示：Methods: Mouse models and treatments, 细菌培养和定量 |
| 药物处理 | rapamycin剂量（4 mg/kg，术前1天单次，术后隔天给药）；gefitinib剂量（17 mg/kg/天，感染后第5天开始） 阅读提示：Methods: Mouse models and treatments |