LILR家族表达和预后分析
分析LILR家族在ccRCC中的表达差异及与预后的关系。
基于TCGA-KIRC和四个GEO数据集，利用DESeq2筛选差异表达基因，Kaplan-Meier和单因素Cox回归识别预后相关基因。
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白细胞免疫球蛋白样受体家族在透明细胞肾细胞癌中的综合分析
Comprehensive analysis of the leukocyte immunoglobulin-like receptor family in clear cell renal cell carcinoma.
实验完整度
中包含多数据库转录组分析、风险模型构建、体外细胞实验（敲低LILRB3后增殖迁移检测）及机制验证（PI3K/AKT/mTOR通路），但缺乏体内动物实验。
主要模型
TCGA-KIRC数据集（530例ccRCC及72例癌旁正常组织） Caki-2和A498肾癌细胞系 HEK-293人胚肾细胞系 ccRCC患者肿瘤及癌旁组织样本
重点核对
LILRB3在Caki-2和A498细胞中mRNA和蛋白表达均高于HEK-293细胞（RT-qPCR和Western blot） shLILRB3-1序列（5'-GTGGAGGTTCACATGCTATTA-3'）用于敲低实验，对照序列为NC（5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'） CCK-8增殖实验：96孔板每孔5×10^3细胞，加入10μl CCK-8孵育2h，测450nm吸光度 Transwell迁移实验：8μm孔径，上室300μl无血清培养基含2.5×10^5 cells/ml，下室500μl含10% FBS培养基，孵育24h 风险模型由LILRA2、LILRB2、LILRB3、LILRB5组成，基于StepCox[forward]+Enet[α=0.9]算法
摘要
背景：肾细胞癌（RCC）是一种起源于肾小管上皮的恶性肿瘤，是全球第14常见的癌症，每年导致约18万人死亡。透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是主要亚型，占70-80%的病例。白细胞免疫球蛋白样受体（LILR）家族成员在肿瘤进展和免疫逃逸中的潜力已引起广泛关注。目的：构建基于LILR家族的ccRCC患者预后特征，并探讨其与临床病理特征、免疫微环境和药物敏感性的关系。方法：我们分析了LILR家族在ccRCC中的表达和预后价值，开发了风险评分模型，并检查了其与临床特征、免疫浸润和治疗效果的相关性。研究还探讨了核心基因LILRB3对ccRCC的表达和影响。结果：我们的研究结果表明，LILR家族成员在ccRCC中的异常表达与肿瘤发生和抗肿瘤免疫抑制相关。风险模型增强长期生存预测并支持个性化治疗。结论：这些见解为进一步研究其作为癌症免疫治疗靶点的潜力、改善预测能力和个性化治疗的发展奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LILR家族成员在ccRCC中的表达和预后价值如何，能否构建预后风险模型并探索其在肿瘤免疫微环境和治疗中的作用？
- 核心机制
- LILRB3通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路和PD-L1表达，促进ccRCC细胞增殖和迁移，并可能通过上调PD-L1协助肿瘤免疫逃逸。
- 主要证据
- 体外实验显示，敲低LILRB3显著抑制Caki-2和A498细胞的增殖（CCK-8和克隆形成）和迁移（Transwell）；Western blot显示PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR和PD-L1蛋白水平下调。
- 研究意义
- 研究揭示LILR家族及LILRB3作为ccRCC预后标志物和免疫治疗靶点的潜力，为个性化治疗策略提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
风险预测模型构建与验证
构建并验证基于LILR家族的风险评分模型。
用十种机器学习算法组合，在TCGA训练集构建模型，并在TCGA验证集、E-MTAB-1980和GSE22541中验证，选择C-index最高的模型。
免疫浸润与药物敏感性分析
探讨风险评分与免疫微环境及药物敏感性的关联。
利用ssGSEA、ESTIMATE、TIDE和IPS分析免疫浸润，使用CMap和GDSC预测药物敏感性，并分析Braun等的数据。
LILRB3表达验证
验证LILRB3在ccRCC中的表达水平。
通过RT-qPCR和Western blot检测LILRB3在细胞系中的表达，免疫组化验证组织样本表达，CPTAC分析蛋白丰度。
LILRB3敲低的功能实验
评估LILRB3敲低对ccRCC细胞增殖和迁移的影响。
构建LILRB3敲低细胞系，使用CCK-8、克隆形成和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力。
机制验证
验证LILRB3是否通过PI3K/AKT/mTOR通路和PD-L1发挥作用。
通过RT-qPCR和Western blot检测敲低LILRB3后PI3K/AKT/mTOR通路和PD-L1的表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | HEK-293细胞系 | Procell | -- |
| Caki-2细胞系 | Procell | -- | |
| A498细胞系 | Procell | -- | |
| 细胞转染 | 嘌呤霉素 | Sigma | -- |
| RNA提取 | TRNzol Universal试剂 | Tiangen Biotech | DP424 |
| qRT-PCR | SuperReal PreMix Plus（SYBR Green） | Tiangen Biotech | FP205 |
| LightCycler96 PCR系统 | Roche | -- | |
| 免疫组化 | 兔单克隆抗体LILRB3 | Proteintech | -- |
| 酶标山羊抗兔IgG | Servicebio | -- | |
| Western blot | LILRB3抗体 | Proteintech | 18260-1-AP |
| PD-L1抗体 | Proteintech | 66248-1-lg | |
| PI3K抗体 | Proteintech | 67071-1-lg | |
| p-PI3K抗体 | bioss | Bs-6417R | |
| AKT抗体 | Proteintech | 10176-2-AP | |
| p-AKT抗体 | Proteintech | 80455-1-RR | |
| mTOR抗体 | Proteintech | 66888-1-lg | |
| p-mTOR抗体 | Proteintech | 67778-1-lg | |
| 肌动蛋白抗体 | ZSBB-Bio | TA-09 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Meilunbio | -- |
| 迁移实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系来源（Procell）、shRNA序列、嘌呤霉素筛选浓度和时间 阅读提示：Materials and Methods 2.10 和 2.11 |
| qRT-PCR | 引物序列（补充表2）、循环条件（95°C 15min, 40循环95°C 10s, 60°C 30s）、内参β-Actin、2-ΔΔCT方法 阅读提示：Materials and Methods 2.12 |
| Western blot | 抗体稀释比（均为1:1000）、二抗稀释比（1:2000）、孵育条件（4°C过夜）、TBST洗涤3次每次10min 阅读提示：Materials and Methods 2.14 |
| CCK-8增殖实验 | 细胞密度（5×10^3/孔）、CCK-8体积（10μl）、孵育时间（2h）、检测波长（450nm） 阅读提示：Materials and Methods 2.15 |
| 克隆形成实验 | 细胞数（50、100、200个/孔）、培养时间（约10天）、结晶紫染色浓度和时间（0.1% 30min） 阅读提示：Materials and Methods 2.16 |
| 迁移实验 | 细胞浓度（2.5×10^5 cells/ml）、孔径（8μm）、下室培养基（10% FBS）、上室体积（300μl）、下室体积（500μl）、孵育时间（24h）、固定（4%多聚甲醛30min）、染色（0.1%结晶紫10min） 阅读提示：Materials and Methods 2.17 |
| 风险模型构建 | TCGA-KIRC样本数（530）、训练/测试划分方法（caret包）、算法组合（101种）、模型选择标准（C-index最高）、基因列表（LILRA2、LILRB2、LILRB3、LILRB5） 阅读提示：Materials and Methods 2.4 |
| 免疫浸润分析 | ssGSEA（23种免疫细胞）、ESTIMATE（免疫/基质评分）、TIDE（免疫逃逸）、IPS（免疫原性） 阅读提示：Materials and Methods 2.7 |
| 药物敏感性分析 | CMap（150个DEGs、NCS阈值|NCS|>1且p<0.05）、GDSC（20种TKI）、Braun et al.数据（nivolumab和everolimus） 阅读提示：Materials and Methods 2.8 |