建立博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型及分组处理
建立PF模型，评估OMT的治疗效果。
对C57BL/6小鼠气管内注射博来霉素（5 mg/kg）诱导PF，随后分组进行OMT（10和40 mg/kg）灌胃、NAC（150 mg/kg）腹腔注射、APE1敲低（AAV-siAPE1）和mdivi-1处理，持续21天。
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氧化苦参碱通过APE1介导的PINK1/Parkin通路调控减轻肺纤维化
Oxymatrine attenuates pulmonary fibrosis via APE1‑mediated regulation of the PINK1/Parkin pathway.
实验完整度
高包含动物模型、细胞实验和机制验证（APE1敲低、mdivi-1抑制）等多个独立证据层级，且明确验证了功能与机制。
主要模型
C57BL/6小鼠博来霉素诱导的肺纤维化模型 Lewis肺癌（LLC）小鼠肺癌细胞
重点核对
博来霉素诱导小鼠PF模型：8周龄雄性C57BL/6小鼠，气管内给予5 mg/kg博来霉素 OMT给药剂量：10和40 mg/kg，每日灌胃，持续21天 NAC阳性对照：150 mg/kg，每日腹腔注射，持续21天 APE1敲低：AAV-siAPE1尾静脉注射1×10^11载体基因组 mdivi-1处理：10 mg/kg，每周两次灌胃
摘要
肺纤维化（PF）是一种慢性、进行性肺部疾病，其特征是气体交换受损和呼吸困难，最终可导致呼吸衰竭和死亡。本研究探讨了氧化苦参碱（OMT）在博来霉素诱导的8周龄C57BL/6小鼠PF模型中的治疗效果和潜在机制。结果表明，OMT减轻了肺组织损伤、炎症和胶原沉积，同时促进自噬并恢复线粒体功能。OMT通过上调无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶-1（APE1）并激活PTEN诱导激酶1（PINK1）/Parkin通路来实现这些效应，这两者都是线粒体自噬的关键。此外，用含有小干扰RNA APE1和阴性对照的腺相关病毒转导Lewis肺癌小鼠肺癌细胞，并通过逆转录-定量PCR和western blotting验证了沉默效率。结果显示，与阴性对照敲低组相比，APE1敲低组的APE1表达显著降低。免疫组织化学和免疫荧光证实OMT增加了APE1、PINK1和Parkin的表达，同时减少了纤维化标志物，如α-平滑肌肌动蛋白和I型胶原α1。然而，沉默APE1或用线粒体分裂抑制剂-1抑制线粒体自噬逆转了OMT的有益作用，提示APE1和PINK1/Parkin通路在其作用机制中的关键作用。这些发现为OMT的抗纤维化潜力提供了见解，并强调了其作为开发PF新疗法基础的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- OMT是否通过APE1介导的PINK1/Parkin通路调节线粒体自噬来减轻肺纤维化？
- 核心机制
- OMT通过上调APE1表达，激活PINK1/Parkin通路，促进线粒体自噬，从而减轻肺纤维化。
- 主要证据
- 在博来霉素诱导的小鼠PF模型中，OMT处理提高了APE1、PINK1和Parkin表达，并促进LC3/TOM20共定位；而APE1敲低或mdivi-1抑制线粒体自噬逆转了OMT的抗纤维化效果。
- 研究意义
- 为OMT作为肺纤维化潜在治疗药物提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估肺组织病理变化、胶原沉积和细胞凋亡
确定OMT对肺损伤、胶原沉积和凋亡的影响。
通过H&E染色评估肺损伤，Masson三色染色评估胶原沉积，TUNEL染色检测凋亡。
检测纤维化标志物和通路蛋白表达
验证OMT对纤维化标志物和APE1/PINK1/Parkin通路的影响。
通过免疫组化检测α-SMA、COL1a1、APE1、PINK1和Parkin的表达；通过Western blotting检测APE1、PINK1和Parkin蛋白水平；通过免疫荧光检测LC3和TOM20共定位。
验证APE1敲低和线粒体自噬抑制对OMT效果的影响
确定APE1和线粒体自噬在OMT抗纤维化作用中的必要性。
在OMT处理基础上，分别沉默APE1或给予mdivi-1，评估肺损伤、胶原沉积、凋亡和通路蛋白表达的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 氧化苦参碱 | Beyotime Institute of Biotechnology | SM4048 |
| 模型诱导 | 博来霉素 | Beyotime Institute of Biotechnology | ST1450 |
| 阳性对照 | N-乙酰半胱氨酸 | MilliporeSigma | A7250 |
| 线粒体自噬抑制 | 线粒体分裂抑制剂-1 | MilliporeSigma | M0199 |
| 组织固定 | 中性福尔马林 | -- | -- |
| H&E染色 | Harris苏木素 | MDL | MD911477 |
| 伊红 | -- | -- | |
| Masson染色 | Masson染色试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | C0189M |
| TUNEL染色 | TUNEL染色试剂盒 | Roche Diagnostics | 11684817910 |
| 免疫组化/免疫荧光封片 | 中性树胶 | MDL | MD911683 |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 11875-093 |
| 胎牛血清 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 慢病毒包装 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂盒 | Takara Bio | 6110A |
| SYBR Green PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | 89900 |
| Western blotting | ECL Plus化学发光液 | Cytiva | RPN2232 |
| 免疫组化封闭 | BSA封闭液 | Bioss | C05-06002 |
| 免疫组化二抗 | 生物素化二抗 | Vector Laboratories | BA1000-1.5 |
| 免疫组化 | 链霉亲和素-HRP偶联物 | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology | SAP-9100 |
| 免疫组化/免疫荧光显色 | DAB显色试剂盒 | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology | ZLI-9017 |
| 免疫荧光二抗 | Alexa Fluor 488偶联二抗 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| Alexa Fluor 594偶联二抗 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | A-11012 | |
| 免疫荧光核染色 | DAPI | MilliporeSigma | D9542 |
| 免疫荧光封片 | 防淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36930 |
| 组织切片 | 石蜡包埋系统 | Leica Biosystems | G1150H |
| 石蜡切片机 | Leica Biosystems | RM2235 | |
| 烤片机 | Leica Biosystems | HI1220 | |
| 显微镜观察 | 光学显微镜 | Leica Microsystems | DM500 |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | Leica Microsystems | DMi8 |
| 共聚焦显微镜 | 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM |
| RT-qPCR | StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞系 | LLC细胞 | Wuhan Pricella Biotechnology | CL-0140 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、年龄、体重、博来霉素剂量和给药途径 阅读提示：Materials and methods - Experimental design |
| OMT治疗 | OMT剂量、给药方式（灌胃）、给药频率（每日）、持续时间（21天） 阅读提示：Materials and methods - Experimental design |
| 分组 | 分组数（7组），每组样本量（n=6），随机化方法（基于体重和编号） 阅读提示：Materials and methods - Experimental design |
| APE1敲低 | AAV-siAPE1的剂量（1×10^11载体基因组），给药途径（尾静脉注射），siRNA序列 阅读提示：Materials and methods - Experimental design |
| mdivi-1处理 | mdivi-1剂量（10 mg/kg），给药方式（灌胃），频率（每周两次） 阅读提示：Materials and methods - Experimental design |
| 细胞实验 | LLC细胞培养条件（RPMI-1640, 10%FBS, 1%P/S, 37°C, 5%CO2），转染条件（MOI=100, 8μg/ml polybrene, 24h），稳定细胞系筛选（2μg/ml puromycin 5天） 阅读提示：Materials and methods - Cell culture and transduction |
| RT-qPCR | 引物序列，热循环条件，内参基因（GAPDH），分析方法（2^-ΔΔCq） 阅读提示：Materials and methods - RT-qPCR |
| Western blotting | 蛋白上样量（50μg），凝胶浓度（10%），抗体稀释度，内参（GAPDH） 阅读提示：Materials and methods - Western blotting |
| 组织染色 | 切片厚度（4μm），染色条件（H&E, Masson, TUNEL, IHC, IF），抗体稀释度 阅读提示：Materials and methods - H&E staining, Masson's trichrome staining, TUNEL staining, Immunohistochemistry, Immunofluorescence |