制备HQT含药血清
获得含有HQT活性成分的血清用于体外实验
Wistar大鼠随机分为对照组和HQT组，HQT组灌胃给予37.6 g/kg HQT，每日一次，连续7天；对照组给予等量生理盐水。最后灌胃2小时后采集腹主动脉血，制备含药血清。
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中药复方化瘀强身通痹汤通过CD63增强脂肪间充质干细胞来源的外泌体miR-125b-5p的释放来改善类风湿关节炎
Chinese herbal formula Huayu-Qiangshen-Tongbi decoction ameliorates rheumatoid arthritis through enhancing the release of exosomal miR-125b-5p derived from adipose-derived stem cells by CD63.
实验完整度
高包含细胞共培养、外泌体分离与功能验证、shRNA敲低、CHX蛋白降解实验、荧光素酶报告基因及CIA大鼠体内模型等多个独立证据层级。
主要模型
人成纤维样滑膜细胞MH7A细胞 人脂肪间充质干细胞ADSCs 胶原诱导关节炎（CIA）大鼠模型
重点核对
ADSCs经25% HQT含药血清处理48小时 MH7A细胞经1 µg/mL LPS处理24小时建立RA细胞模型 GW4869（10 µM）处理ADSCs以阻断外泌体生成 使用shRNA敲低ADSCs中miR-125b-5p和CD63 CIA大鼠模型关节腔内注射2×10^9个外泌体，每3天一次，持续30天
摘要
背景：类风湿关节炎（RA）是一种慢性多因素炎症性疾病，可导致关节和关节外器官损伤。我们前期的研究表明，化瘀强身通痹汤（HQT）通过上调microRNA（miRNA）miR-125b-5p抑制类风湿成纤维样滑膜细胞（FLSs）的炎症，从而改善RA。然而，HQT增加FLSs中miR-125b-5p水平的机制仍不清楚。已有报道称，脂肪间充质干细胞（ADSCs）来源的外泌体miR-125b-5p可改善多种疾病，但HQT治疗下ADSCs来源的外泌体miR-125b-5p对RA中FLSs的作用尚不清楚。目的是研究HQT是否通过修饰ASCs来源的外泌体miR-125b-5p来上调FLSs中的miR-125b-5p。方法：制备含HQT血清，进行人FLS MH7A细胞与ADSCs的共培养，通过短发夹RNA（shRNA）评估ADSCs中的基因敲低，在放线菌酮（CHX）处理后鉴定蛋白质降解，并收集ADSC来源的外泌体与MH7A细胞孵育并注射到RA大鼠模型中。结果：HQT通过增强ADSCs来源的外泌体miR-125b-5p的分泌，升高了脂多糖（LPS）降低的FLSs中miR-125b-5p水平。此外，在体外和体内，HQT通过ADSCs来源的外泌体miR-125b-5p减轻了RA中FLSs的炎症。机制上，HQT抑制ADSCs中CD63的降解，以促进ADSCs来源的外泌体miR-125b-5p的释放。结论：总之，这些发现揭示了HQT升高FLSs中miR-125b-5p表达的机制，并为RA治疗提供了新的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HQT是否通过修饰ASCs来源的外泌体miR-125b-5p，经CD63上调FLSs中的miR-125b-5p水平，从而减轻RA炎症？
- 核心机制
- HQT抑制ADSCs中CD63蛋白降解，促进外泌体miR-125b-5p的释放，外泌体转移至FLSs后抑制NF-κB通路，降低IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子水平。
- 主要证据
- 细胞共培养及外泌体处理实验显示HQT升高LPS降低的miR-125b-5p并抑制炎症；CD63敲低降低外泌体miR-125b-5p释放；CHX实验证实HQT抑制CD63降解；CIA大鼠模型中注射HQT处理的ADSC外泌体减轻关节损伤和炎症。
- 研究意义
- 揭示了HQT升高FLSs中miR-125b-5p表达的机制，为RA治疗提供了新的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞培养与处理
建立RA细胞模型并观察HQT对ADSCs和MH7A细胞的影响
人ADSCs用含10% FBS等成分的专用培养基培养；MH7A细胞用DMEM培养。ADSCs分别用5%、15%、25% HQT含药血清处理48小时；部分实验用GW4869预处理ADSCs；MH7A细胞用1 µg/mL LPS处理24小时诱导炎症。
Transwell共培养
验证ADSCs通过外泌体介导对MH7A细胞miR-125b-5p水平的影响
MH7A细胞接种于12孔Transwell下室，ADSCs接种于上室（0.4 µm孔径），共培养48小时后检测MH7A细胞miR-125b-5p水平。
外泌体分离与特征鉴定
确认从ADSC培养上清中成功分离外泌体
使用ExoEasy Maxi Kit分离ADSC培养上清中的外泌体，通过纳米颗粒跟踪分析检测外泌体大小，并通过Western blot检测外泌体标志物CD63和CD81。
外泌体摄取实验
验证ADSC来源外泌体能否被MH7A细胞摄取
ADSC来源外泌体用PKH26染色后与MH7A细胞共培养，荧光显微镜观察MH7A细胞中的红色荧光。
炎症因子与NF-κB通路检测
评估外泌体miR-125b-5p对FLSs炎症的影响
ELISA检测MH7A细胞上清和CIA大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平；Western blot检测MH7A细胞中NF-κB p65水平。
基因敲低实验
验证miR-125b-5p和CD63在ADSCs中的功能
构建针对pre-miR-125b或CD63的shRNA克隆至pLOV-CMV载体，与包装质粒共转染293T细胞产生病毒，感染ADSCs，通过qRT-PCR验证敲低效率。
荧光素酶报告基因实验
检测HQT对CD63基因转录活性的影响
将CD63基因启动子克隆至pmirGLO荧光素酶报告载体，转染ADSCs后检测相对荧光素酶活性。
蛋白质降解实验
验证HQT是否抑制CD63蛋白降解
ADSCs用50 µg/mL CHX和HQT含药血清处理3、6、12小时，Western blot检测CD63蛋白水平。
CIA大鼠模型建立与外泌体治疗
评估ADSC来源外泌体在体内对RA的改善作用
雄性Wistar大鼠随机分为5组，用胶原诱导建立RA模型，关节腔内注射外泌体（每3天一次，共30天），最后评估关节炎指数、血清炎症因子。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 人脂肪间充质干细胞完全培养基 | Procell | CM-H205 |
| 胎牛血清 | HyClone | SH30087.01 | |
| 青霉素-链霉素 | HyClone | SH30010 | |
| DMEM培养基 | HyClone | SH30022.01B | |
| 细胞处理 | GW4869 | Selleck | S7609 |
| 脂多糖 | Sigma | L2880 | |
| 共培养 | 12孔Transwell滤板 | Corning | CLS3460 |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| All-in-One™ miRNA qRT-PCR检测试剂盒 | GeneCopoeia | AOMD-Q050 | |
| 7500 Fast实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒 | Takara | 6210A | |
| TB Green Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420A | |
| CCK-8实验 | CCK-8溶液 | Beyotime | C0037 |
| 酶标仪（Multiscan MK3） | Thermo Fisher Scientific | Multiscan MK3 | |
| 流式凋亡 | Annexin V-FITC | Keygen | KGA106 |
| 碘化丙啶 | Keygen | KGA106 | |
| 流式细胞仪（BD Calibur） | BD Biosciences | -- | |
| 外泌体分离 | ExoEasy Maxi试剂盒 | QIAGEN | 76064 |
| 外泌体鉴定 | 纳米颗粒跟踪分析仪（N30E） | NanoFCM | N30E |
| CD9抗体 | Bioss | bs-5660R | |
| CD81抗体 | Bioss | bs-2489R | |
| 外泌体摄取 | PKH26 | Umibio | UR52302 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | 89900 |
| PVDF膜 | Millipore | IPFL00010 | |
| BeyoECL Moon试剂盒 | Beyotime | P0018F | |
| CD63抗体 | Bioss | bs-1523R | |
| NF-κB p65抗体 | Bioss | bs-5660R | |
| GAPDH抗体 | Aksomics | KC-5G5 | |
| 基因敲低 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| 荧光素酶报告基因 | pmirGLO荧光素酶报告载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | ADSCs和MH7A细胞的来源（中国科学院细胞库）、培养基成分（ADSCs：Human Adipose-derived Stem Cell Complete Culture Medium；MH7A：DMEM）、血清和双抗浓度、培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Materials and methods：Cell culture |
| HQT含药血清制备 | 大鼠品系、性别、周龄（Wistar，雄性，8周）、HQT给药剂量（37.6 g/kg）和方式（口服灌胃，每日一次，7天）、采血时间（末次灌胃后2小时） 阅读提示：Materials and methods：Preparation of HQT-containing serum |
| 细胞处理 | HQT含药血清浓度（5%、15%、25%）和处理时间（48小时）、LPS浓度（1 µg/mL）和处理时间（24小时）、GW4869浓度（10 µM）和处理时间（2小时） 阅读提示：Materials and methods：Cell treatments |
| 共培养 | Transwell孔径（0.4 μm）、细胞密度（MH7A和ADSCs各2×10^5/mL）、共培养时间（48小时） 阅读提示：Materials and methods：Co-culture of MH7A cells with ADSCs |
| 外泌体分离和鉴定 | 外泌体分离试剂盒（ExoEasy Maxi Kit）、外泌体大小（50-200 nm）、标志物（CD63、CD81） 阅读提示：Materials and methods：Isolation and analysis of ADSC-derived exosomes |
| 基因敲低 | shRNA载体（pLOV-CMV）、包装质粒（pMDL、psPAX2）、转染试剂（Lipofectamine 2000）、感染时间（48小时） 阅读提示：Materials and methods：Knockdown of miR-125b-5p and CD63 in ADSCs |
| 蛋白降解检测 | CHX浓度（50 µg/mL）、处理时间点（3、6、12小时）、检测方法（Western blot） 阅读提示：Materials and methods：Cycloheximide treatment |
| 动物模型 | 大鼠品系、性别、周龄（Wistar，雄性，8周）、分组（5组，每组5只）、外泌体注射剂量（2×10^9个）和方式（关节腔内注射，每3天一次，持续30天）、关节炎指数评估 阅读提示：Materials and methods：Establish of RA rat model |
| 统计分析 | 所有实验重复三次，统计方法（Mann-Whitney U检验、Student's t检验、单因素方差分析及Tukey事后检验），显著性水平（P<0.05） 阅读提示：Materials and methods：Statistical analyses |