Site- and cell-type-specific miRNA and mRNA genes and networks across the cortex, striatum, and hypothalamus.
研究包含转录组测序分析、生物信息学节律检测、共表达网络分析及免疫荧光蛋白验证，多个独立证据层级支持结论。
C57BL/6J雄性小鼠的皮层组织 C57BL/6J雄性小鼠的下丘脑组织 C57BL/6J雄性小鼠的纹状体组织 C57BL/6J雄性小鼠的肝脏组织（对照）
转录组数据分析中，MetCycle和RAIN检测到的循环基因及其周期、相位和相对振幅 mRNA-miRNA共表达对的鉴定及其潜在直接相互作用 少突胶质细胞中IL-33蛋白的节律性表达（ZT8 vs ZT14） 皮层神经元中Fz-4蛋白的节律性表达（ZT8峰值） 下丘脑神经元中AdipoR2蛋白的节律性表达（ZT14峰值）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
处理公开的转录组测序数据，进行质量控制和标准化，为后续节律分析提供可靠的数据。
使用SRA-Toolkit下载GSE151567数据，经FastQC和MultiQC质量控制，Trimmomatic过滤，Hisat2比对到小鼠基因组，StringTie定量mRNA；miRNA则用CutAdapt和STAR处理。去除低比对率样本，使用arrayQualityMetrics和edgeR进行异常值检测和TMM标准化，最终获得各组织的表达矩阵。
使用多种算法识别具有24小时周期和非24小时周期的循环mRNA和miRNA。
使用MetaCycle（meta2d）检测24小时周期，RAIN检测非24小时周期，ARSER用于补充分析。采用Benjamini-Hochberg校正，调整P<0.05为循环。
比较不同脑区和肝脏中循环基因的异同，评估其特异性。
通过交集分析、周期和相位差异比较，识别组织特异性和共有的循环基因。
识别循环mRNA与miRNA之间的共表达关系，并推断潜在的调控作用。
使用lmms和dynOmics折叠重复样本，计算延迟Pearson相关性，关联显著的mRNA-miRNA对（PBH<0.05），负相关且延迟≤0的视为miRNA直接靶标。与多Mir数据库比较。
构建mRNA和miRNA的共表达模块，识别富集循环基因的模块及其细胞类型特征。
使用WGCNA分别构建mRNA和miRNA加权共表达网络，计算模块特征基因，超几何检验富集循环基因和细胞类型标记，并用Cytoscape可视化关键模块。
在蛋白水平验证部分循环基因的节律性及细胞特异性。
对C57BL/6J小鼠进行灌注固定，切片，免疫荧光染色，使用共聚焦显微镜拍照，定量荧光强度。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 转录组测序 | Trimmomatic | -- | v0.36 |
| mRNA比对 | Hisat2 | -- | v2.2.1 |
| mRNA定量 | StringTie | -- | v2.1.5 |
| miRNA比对 | STAR | -- | v2.7.9a |
| 节律分析 | MetaCycle | -- | v1.2.0 |
| RAIN | -- | v1.38.0 | |
| 共表达分析 | WGCNA | -- | v1.72-5 |
| 免疫荧光 | 抗IL-33抗体 | R&D Systems | AF3626 |
| 抗AdipoR2抗体 | Bioss | BS-0611R | |
| 抗FZD4抗体 | Sigma-Aldrich | SAB4503265 | |
| 抗EIF1B抗体 | Abbexa Ltd | ABX326521 | |
| 抗LRRK2抗体 | Abcam | ab133474 | |
| 抗SPHK2抗体 | Proteintech | 17096-1-AP | |
| 抗转铁蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | ZRB1225 | |
| 抗NeuN抗体 | Sigma-Aldrich | MAB377 | |
| 抗Iba1抗体 | Wako | 019-19741 | |
| 抗Iba1抗体 | Synaptic Systems | 234 009 | |
| 抗GFAP抗体 | Invitrogen | 13-0300 | |
| 抗Olig2抗体 | Sigma-Aldrich | MABN50 | |
| Alexa Fluor二抗 | Invitrogen | 1:500 | |
| DAPI封片剂 | Life Technologies | -- | |
| 图像采集 | Eclipse Ti2显微镜 | Nikon | -- |
| 图像分析 | ImageJ | NIH | -- |
| 数据下载 | SRA-Toolkit | -- | v2.10.8 |
| 质量控制 | FastQC | -- | v0.11.9 |
| 数据下载 | 基因表达汇编 | NCBI | GSE151567 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 转录组数据分析 | 样本采集时间间隔（3小时）、时间范围（36小时）、每个时间点的生物学重复数（2-6个）、光照周期（12:12）、小鼠品系（C57BL/6J）、年龄（26周）、性别（雄性）、数据来源（GSE151567） 阅读提示：Methods: Transcriptomics analysis study design & data description |
| 循环基因检测 | 算法参数：MetaCycle周期固定24h，RAIN period=17, period.delta=13；多重检验校正方法（Benjamini-Hochberg）；显著性阈值（调整P<0.05）；数据标准化和异常值处理方法（TMM、arrayQualityMetrics） 阅读提示：Methods: Identifying rhythmic features |
| mRNA-miRNA关联分析 | 关联方法（延迟Pearson相关）；直接靶标定义（负相关、延迟≤0）；多重检验校正（BH）；数据库（multiMiR）及预测算法 阅读提示：Methods: Integrating mRNA and miRNA pairwise |
| 共表达网络分析 | WGCNA参数：软阈值（mRNA: 16, 16, 18, 16；miRNA: 4, 5, 6, 9）；模块检测算法（动态树切）；循环基因富集检验（超几何检验）；细胞类型标记基因集 阅读提示：Methods: Identifying co-expression networks of mRNA and miRNA |
| 免疫荧光验证 | 动物年龄（20-30周）、性别（雄性）、品系（C57BL/6J）；灌注固定方法（4%多聚甲醛）；切片厚度（16μm）；抗体稀释度；图像采集与定量方法（ImageJ）；每个时间点动物数（n=4） 阅读提示：Methods: Immunohistochemistry and Image analysis |
