AML中ST2+ Treg细胞富集分析
评估ST2+ Treg细胞在AML患者和小鼠模型骨髓中的富集情况及其与疾病进展的关系
利用TCGA/TARGET、GTEX、GEO等数据库进行ssGSEA分析，比较AML患者与健康供者骨髓中ST2+ Treg细胞富集分数；收集AML患者骨髓样本进行流式细胞术检测ST2+ Treg细胞频率；在DNMT3A/FLT3ITD和MLL-AF9小鼠白血病模型中动态监测ST2+ Treg细胞频率。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
ST2/IL-33轴阻断抑制白血病微环境中调节性T细胞对CD8 T细胞的细胞毒性
ST2/IL-33 axis blockade inhibits regulatory T cell cytotoxicity towards CD8 T cells in the leukemic niche.
实验完整度
高体外共培养杀伤实验、Treg细胞过继转移、条件性基因敲除小鼠模型、体内抗体治疗、多组学分析（RNA-seq、scRNA-seq）及多种AML小鼠模型验证。
主要模型
MLL-AF9eGFP小鼠白血病模型 DNMT3A/FLT3ITD小鼠白血病模型 MOLM-14人白血病细胞系异种移植NSG小鼠模型 AML患者骨髓样本
重点核对
ST2+ Treg细胞在AML骨髓中的富集随疾病进展而增加 ST2缺陷Treg细胞可恢复CD8 T细胞功能并抑制AML生长 ST2+ Treg细胞通过颗粒酶B介导的接触依赖性杀伤CD8 T细胞 抗ST2抗体治疗可诱导ST2+ Treg细胞凋亡并延长AML小鼠生存期
摘要
急性髓系白血病（AML）患者表现出CD8耗竭特征，药理学检查点抑制可具有治疗益处。警报素IL-33及其受体STimulation-2（ST2）促进组织调节性T细胞（Treg细胞）的激活，并加速实体瘤的恶性进展，但其在白血病中的作用仍不清楚。在这里，我们发现ST2+ Treg细胞在人类和小鼠AML的骨髓（BM）中富集，并促进CD8+ T细胞的耗竭和衰竭。Treg细胞中ST2缺陷通过将ST2+ Treg细胞前体滞留在淋巴结中，恢复CD8+ T细胞功能，从而减少AML生长。AML激活的ST2+ Treg细胞缺乏T-bet、IFN-γ和Bcl-6，并通过增强的颗粒酶B介导的细胞毒性杀死瘤内CD8+ T细胞，而非AML引发的Treg细胞则不然。工程化抗ST2抗体诱导ST2+ Treg细胞凋亡，延长AML模型的生存期。总之，我们的发现表明ST2是AML免疫治疗的潜在检查点靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ST2/IL-33轴在急性髓系白血病（AML）中是否通过调节性T细胞（Treg细胞）影响CD8 T细胞功能和肿瘤进展？
- 核心机制
- ST2+ Treg细胞通过增强颗粒酶B介导的细胞毒性杀伤瘤内CD8 T细胞，导致CD8 T细胞耗竭和衰竭，从而促进AML进展；Treg细胞中T-bet抑制ST2+ Treg细胞的活化及促细胞毒性表型。
- 主要证据
- 在多种AML小鼠模型和患者样本中，ST2+ Treg细胞频率与CD8 T细胞耗竭标志物正相关，与CD8 T细胞功能和细胞毒性分子负相关；体内外实验证明ST2+ Treg细胞通过颗粒酶B直接杀伤CD8 T细胞；ST2缺陷或抗ST2抗体治疗可恢复CD8 T细胞功能、抑制AML生长并延长生存。
- 研究意义
- ST2/IL-33轴是AML免疫治疗的潜在检查点靶点，靶向ST2+ Treg细胞（如抗ST2抗体）在临床前模型中显示出治疗前景，有望为AML患者提供新的免疫治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ST2+ Treg细胞功能与表型鉴定
评估ST2+ Treg细胞与ST2- Treg细胞在细胞因子分泌、抑制能力和细胞毒性方面的差异
通过流式细胞术检测ST2+ Treg细胞中TGFβ、IL-10、LAG3、TIM3、GITR等分子表达；进行免疫抑制实验比较ST2+和ST2- Treg细胞对CD8 T细胞增殖的抑制能力；通过共培养实验检测ST2+ Treg细胞对CD8 T细胞的杀伤能力。
ST2缺陷Treg细胞的过继转移实验
评估ST2缺陷Treg细胞对AML小鼠模型中CD8 T细胞功能、肿瘤生长和生存期的影响
从ST2-/-Foxp3eGFP或WT Foxp3eGFP小鼠中分选Treg细胞，与常规T细胞混合后过继转移至经致死辐照并接种MLL-AF9白血病细胞的小鼠，监测生存期、肿瘤负荷、CD8 T细胞频率和功能。
Treg细胞特异性ST2条件敲除小鼠实验
在非辐照AML模型中验证Treg细胞中ST2缺失对AML进展、CD8 T细胞功能和抗肿瘤免疫的影响
使用Foxp3CreST2fl/fl条件敲除小鼠（Treg细胞特异性ST2缺失）和Foxp3Cre对照小鼠，接种MLL-AF9eGFP白血病细胞，监测生存期、白血病负担、CD8 T细胞频率和功能、WT1特异性CD8 T细胞反应。
ST2+ Treg细胞杀伤CD8 T细胞机制研究
验证ST2+ Treg细胞是否通过颗粒酶B介导的接触依赖性机制直接杀伤CD8 T细胞
将从白血病小鼠骨髓中分选的ST2+ Treg细胞与CD8 T细胞共培养，使用SYTOX-Blue染色检测细胞毒性；使用transwell实验验证接触依赖性；使用GZMB抑制剂Z-AAD-CMK处理验证颗粒酶B依赖性；体内杀伤实验使用CFSE标记的CD8 T细胞过继转移。
抗ST2抗体治疗效果评估
评估工程化抗ST2抗体在免疫健全和人类化AML小鼠模型中的治疗效果及其对免疫细胞的影响
在MLL-AF9白血病小鼠和MOLM-14异种移植NSG小鼠中，给予抗ST2抗体（IgG-281或IgG-282）或对照IgG，监测生存期、肿瘤负荷、ST2+ Treg细胞凋亡、CD8 T细胞功能及耗竭标志物变化。
抗ST2抗体在DNMT3A/FLT3ITD小鼠模型中的疗效及细胞空间分布评估
评估抗ST2抗体在DNMT3A/FLT3ITD小鼠白血病模型中的疗效，并分析ST2+ Treg细胞与CD8 T细胞的共定位变化
对DNMT3A/FLT3ITD小鼠移植后给予抗ST2抗体或对照抗体，测量脾脏和肝脏大小及重量、免疫细胞频率；使用共聚焦显微镜成像分析脾脏中ST2+ Treg细胞与CD8 T细胞的距离。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Hyclone | SH30073.03 |
| 青霉素和链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 动物实验 | 无内毒素PBS | Millipore | 6C1766 |
| 0.22微米过滤器 | Thermo Scientific | 09-720-03 | |
| 内毒素检测 | LAL显色内毒素定量试剂盒 | Thermo Scientific | 88282 |
| 细胞培养 | MLL-AF9eGFP细胞系 | -- | -- |
| MOLM-14细胞系 | ATCC | -- | |
| 流式细胞术 | 小鼠ST2-PE抗体（克隆DJ8） | MD Biosciences | 101001PE |
| 人ST2-FITC抗体（克隆B4E6） | MD Biosciences | 101002F | |
| 可固定活力染料（FVD） | eBioscience | 65-0866-14 | |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 固定/破膜试剂盒 | BD Biosciences | 555028 | |
| PMA（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯） | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | 56092-82-1 | |
| GolgiStop莫能菌素 | eBioscience | 00-4505-51 | |
| 抗小鼠WT1多克隆抗体偶联Alexa Fluor 594 | Bioss | bs-6983R-A594 | |
| 抗小鼠CD16/CD32单克隆抗体 | -- | -- | |
| 细胞分选 | CD25磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-091-041 |
| 抗APC MultiSort试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-091-255 | |
| 抗PE磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| 抗FITC磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| CD8a+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| 肿瘤浸润CD8 T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-116-478 | |
| LS磁式细胞分选柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| T细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | |
| CD25去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-091-072 | |
| Ficoll-Paque PREMIUM密度梯度离心液 | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
| 人CD8 T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-045-201 | |
| 人Treg细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-091-301 | |
| 免疫抑制实验 | CFSE染料 | Invitrogen | C34554 |
| 抗CD3抗体（克隆145-2C11） | Biolegend | 100301 | |
| 抗CD28抗体（克隆37.51） | Biolegend | 102101 | |
| 细胞毒性实验 | SYTOX-Blue染料 | Invitrogen | S34857 |
| 重组小鼠IL-33 | R&D Systems | 3626-ML | |
| GZMB抑制剂Z-AAD-CMK | Millipore-Sigma | 368050 | |
| 体内杀伤实验 | CFSE染料 | Invitrogen | S34554 |
| 成像流式细胞术 | Amnis ImageStream Mk II成像流式细胞仪 | Luminex | -- |
| 共聚焦显微镜 | ibidi μ-slide 8孔腔室 | Ibidi | 50-305-795 |
| 5% UltraCruz封闭液 | Santa Cruz Biotechnology | sc-516214 | |
| DAPI核染料 | Invitrogen | D1306 | |
| Leica SP8共振扫描共聚焦/多光子显微镜 | Leica | -- | |
| 测序 | PureLink RNA微量提取试剂盒 | Invitrogen | 12183-016 |
| nCounter小鼠免疫学试剂盒 | nanoString | XT-CSO-MIM1-12 | |
| KAPA Hyperprep文库制备试剂盒 | Roche | 07962363001 | |
| QIAseq FastSelect rRNA去除试剂盒 | QIAGEN | 333390 | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 单细胞测序 | Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v2 | 10x Genomics | -- |
| Chromium Next GEM单细胞3' GEM、文库和凝胶珠试剂盒v2 | 10x Genomics | -- | |
| 蛋白表达与纯化 | Expi293表达系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| HEK 293T细胞 | -- | -- | |
| 蛋白纯化 | Superdex S200 10/300GL 凝胶过滤色谱柱 | GE Healthcare | -- |
| AKTA蛋白质纯化系统 | GE Healthcare | -- | |
| SPR | CM5传感芯片 | -- | -- |
| ELISA | 小鼠ST2蛋白 | Sino Biologics | 51143-M08H |
| 人ST2蛋白 | Acro | IL1-H5229 | |
| 药物处理 | 抗CD25抗体（克隆PC61） | -- | -- |
| 同型对照抗体（大鼠IgG1） | -- | -- | |
| 抗ST2抗体（IgG-281） | -- | -- | |
| 抗人ST2抗体（IgG-282） | -- | -- | |
| 对照抗体（IgG-283） | -- | -- | |
| 抗PD-1抗体 | -- | -- | |
| 抗Tbet抗体（克隆39D） | Invitrogen | -- | |
| 正常兔IgG（ChIP试剂盒提供） | -- | -- | |
| 正常IgG1（克隆MG1-45） | BioLegend | -- | |
| ChIP-qPCR | Pierce琼脂糖ChIP试剂盒 | Thermo Scientific | 26156 |
| qPCR | Scavenged Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725270 |
| 细胞系 | ST2fl/fl小鼠 | Cyagen Biosciences | TKC-190220-AHL-01-tac |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AML患者样本分析 | AML患者骨髓样本分组（完全缓解CR vs 难治性Ref），样本量、化疗后原始细胞比例≤20%限制；ST2+ Treg细胞、KLRG1+ST2+ Treg细胞流式检测抗体克隆和浓度 阅读提示：详见Methods中的Human research participants和Flow cytometry部分，以及Fig. 1和图注。 |
| 小鼠白血病模型 | MLL-AF9eGFP和DNMT3A/FLT3ITD白血病细胞剂量（105或106每只）、小鼠品系（C57BL/6、Foxp3eGFP、ST2-/-、Foxp3CreST2fl/fl等）、是否辐照（致死剂量12 Gy）、过继转移的细胞比例和数量 阅读提示：详见Methods中的Mouse strains和Fig. 1D、Fig. 4A、Fig. 5A的图注。 |
| ST2+ Treg细胞功能与杀伤实验 | Treg细胞分选纯度（≥95%）、共培养比例（1:1, 2:1, 4:1）、IL-33浓度（20 ng/ml）、Z-AAD-CMK浓度（50 ng/ml）、共培养时间（6小时）、SYTOX-Blue染色浓度（1:1000） 阅读提示：详见Methods中的Cytotoxicity of Treg cells部分和图8的图注。 |
| 抗ST2抗体治疗实验 | 抗体剂量（50 μg/注射；DNMT3A/FLT3ITD模型首次三剂25 μg，后续50 μg）、给药频率（每3天一次，共3-4次或10次）、MLL-AF9细胞剂量（常规105，低负荷103）、联合anti-PD-1剂量和方案 阅读提示：详见Methods中的Anti-ST2 antibodies部分及Fig. 9、Fig. 10的图注。 |
| Treg细胞特异性ST2敲除小鼠验证 | Foxp3CreST2fl/fl小鼠的基因型验证（PCR和流式确认ST2仅在Treg细胞中缺失）、MLL-AF9eGFP细胞剂量（105每只）、观察时间点（day 14） 阅读提示：详见Methods中的Mouse strains部分和Fig. 5A的图注。 |