AAV-sh.ROCK2的构建与验证
验证AAV-sh.ROCK2能否有效转染脑组织并敲低ROCK2表达。
构建表达shROCK2的AAV9载体，侧脑室注射后通过EGFP表达确认转染，用Western blot检测ROCK2敲低效果。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
腺相关病毒介导的ROCK2抑制促进大鼠缺血性卒中后的突触发生和神经发生
Adeno-associated virus-mediated inhibition of ROCK2 promotes synaptogenesis and neurogenesis in rats after ischemic stroke.
实验完整度
高包含行为学测试、组织学分析（Nissl染色、免疫荧光）、Western blot、激光多普勒血流测量等多个独立实验层级，并且进行了功能验证和机制验证（RhoA/ROC K2通路）。
主要模型
Sprague-Dawley大鼠MCAO模型 AAV-sh.ROCK2处理的MCAO大鼠
重点核对
AAV-sh.ROCK2注射时间（MCAO前14天）及剂量（2×10^10病毒颗粒） MCAO手术持续时间（90分钟缺血再灌注） 行为学测试时间点（术后3、7、14、21、28天） 脑组织取材时间（术后28天） western blot检测RhoA、ROCK2、CRMP2、GAP43表达
摘要
神经突生长和突触发生是缺血性卒中后功能恢复的关键步骤。成年哺乳动物中枢神经系统的受损轴突表现出有限的再生能力，导致持久性神经功能缺损。我们最近的研究结果表明，抑制Rho相关激酶（ROCK）2可促进不同中枢神经系统疾病模型中的神经保护。此外，我们先前的研究表明，轴突保护可增强受损轴突的再生。然而，ROCK2抑制介导的轴突保护是否也促进突触发生仍不清楚。在本研究中，我们旨在利用表达shRNA的腺相关病毒（AAV）载体（AAV-sh.ROCK2）研究抑制ROCK2表达对缺血性卒中中突触发生和神经发生的影响。我们证明AAV-sh.ROCK2在体内增加了神经突生长并促进了突触发生。此外，AAV-sh.ROCK2在大脑中动脉闭塞术后增加了神经元存活并促进了神经发生，以及在缺血/再灌注损伤后促进了长期运动功能恢复。值得注意的是，AAV-sh.ROCK2在缺血/再灌注损伤后还刺激了血清素能和多巴胺能轴突发芽。在机制上，AAV-sh.ROCK2的活性导致抗塌陷反应介导蛋白2激活增加以及RhoA和ROCK2表达减少。我们的研究确定ROCK2是突触发生和神经发生的关键调节因子，强调其是促进缺血性卒中神经保护和再生的有前景的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 抑制ROCK2表达是否能促进缺血性卒中后的突触发生和神经发生，并改善长期神经功能恢复？
- 核心机制
- AAV-sh.ROCK2抑制RhoA/ROCK2通路，减少CRMP2磷酸化（通过增加CRMP2表达），从而促进轴突生长和突触形成。
- 主要证据
- 在MCAO大鼠模型中，AAV-sh.ROCK2处理减少了RhoA和ROCK2表达，增加了CRMP2和GAP43表达，促进了NeuN、DCX、Nestin阳性细胞增多，并改善了行为学表现（mNSS、rotarod、抓力测试）。
- 研究意义
- 该研究将ROCK2确定为突触发生和神经发生的关键调节因子，表明AAV介导的ROCK2基因治疗可能是改善缺血性卒中长期预后的一种潜在方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立MCAO模型
建立局灶性脑缺血/再灌注损伤模型。
采用线栓法阻塞大脑中动脉90分钟，再灌注。
行为学评估
评估长期神经功能恢复。
在术后3、7、14、21、28天进行mNSS、rotarod、抓力测试和体重测量。
组织学分析
评估脑萎缩体积和皮质宽度指数。
术后28天取脑，进行Nissl染色计算脑萎缩百分比，并测量皮质宽度指数。
Western blot检测
检测RhoA/ROCK2通路相关蛋白表达。
提取缺血侧皮层和纹状体蛋白，检测RhoA、ROCK2、CRMP2、GAP43表达。
免疫荧光染色
检测神经发生和突触发生相关标志物。
对脑切片进行免疫荧光染色，检测DCX、Nestin、NeuN、GAP43、SYP表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 异氟烷 | RWD Life Science | -- |
| 手术 | 缝线（L3600） | Jialing | -- |
| 手术监测 | 激光多普勒血流仪（PeriCan PSIZ） | PeriCan | -- |
| 转染验证 | AAV-sh.ROCK2 | Shanghai Jikai Gene Company | -- |
| Western blot | BCA试剂盒 | GLPBIO | -- |
| SDS-PAGE凝胶 | Meilunbio | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 脱脂奶粉 | Phygene | -- | |
| 抗ROCK2抗体 | HUABIO | ER1706-48 | |
| 抗CRMP2抗体 | Proteintech | 14684-1-AP | |
| 抗RhoA抗体 | Immunoway | YM8050 | |
| 抗GAP43抗体 | Abcam | Ab-75810 | |
| 抗β-actin抗体 | HUABIO | EM21002 | |
| 抗GAPDH抗体 | HUABIO | R1210-1 | |
| 山羊抗兔IgG抗体 | HUABIO | HA1001 | |
| 增强化学发光试剂盒 | Meilunbio | -- | |
| 脑组织取材 | 相机（Nikonz30） | Nikon | -- |
| 冷冻切片机 | Leica | -- | |
| 免疫荧光 | 抗GAP43抗体 | Abcam | Ab-75810 |
| 抗SYP抗体 | HUABIO | ET1606-56 | |
| 抗DCX抗体 | Cell Signaling Technology | 4604S | |
| 抗Nestin抗体 | Cell Signaling Technology | 89529S | |
| 抗NeuN抗体 | Abcam | ab-177487 | |
| Alexa Fluor 647偶联的山羊抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 4414S | |
| Alexa Fluor 594偶联的山羊抗兔IgG | Bioss | bs-0295D-BF594 | |
| DAPI | Solarbio | C0065 | |
| 行为学测试 | 转棒仪 | HUAYON | -- |
| 抓力计 | HUAYON | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AAV注射 | 注射时间（MCAO前14天）、病毒剂量（2×10^10病毒颗粒/10 μL）、注射速度（0.4 μL/min）、注射位点（右侧脑室，坐标：前囟后1.0 mm，旁开1.5 mm，深度4.0 mm） 阅读提示：见Methods: Intracerebroventricular injection |
| MCAO模型 | 线栓插入深度（22 mm）、缺血时间（90分钟）、再灌注确认（脑血流降低≥70%）、大鼠品系、性别、周龄、体重 阅读提示：见Methods: Construction of a focal cerebral ischemia/reperfusion injury model |
| 行为学测试 | 测试时间点（术后3、7、14、21、28天）、每组样本量（n=5）、rotarod加速范围（5-40 rpm，5分钟） 阅读提示：见Methods: Behavioral tests及Figure 3 legend |
| 组织学分析 | 取材时间（术后28天）、脑片厚度（35 μm）、Nissl染色方法、脑萎缩体积计算公式 阅读提示：见Methods: Nissl staining and measurement of brain atrophy volume |
| Western blot | 蛋白上样量（20 μg）、抗体稀释比例（如ROCK2 1:1000）、内参（β-actin或GAPDH）、统计分析（n=3） 阅读提示：见Methods: Western blotting及Figure 5 legend |
| 免疫荧光 | 脑片厚度（35 μm）、一抗孵育条件（4℃过夜）、二抗浓度（1:1000）、图像分析（ImageJ） 阅读提示：见Methods: Immunofluorescence staining及Figure 6/7 legends |