鉴定PURB为p53结合蛋白
发现新的p53相互作用的共因子
通过双亲和纯化从表达SFB标记p53的H1299细胞中纯化p53复合物，并通过LC-MS/MS鉴定PURB。
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PURB-HOTAIR复合物调控p53依赖的启动子特异性转录激活
The PURB-HOTAIR complex regulates p53-dependent promoter-specific transcriptional activation.
实验完整度
高包含生化纯化、体外结合、细胞功能实验、ChIP、CLIP、CRISPR敲除、RNA-seq及异种移植瘤模型等多种证据层级，且包含机制验证。
主要模型
H1299细胞系（p53缺失） HCT116细胞系（p53野生型）及其p53缺失衍生物 U2OS细胞系（p53野生型） A375细胞系（p53野生型） MCF-7细胞系（p53野生型） 裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
H1299细胞系（p53缺失）用于转染和蛋白表达 HCT116细胞系（p53野生型）用于内源性p53和PURB检测及p53敲除 U2OS细胞系（p53野生型）用于HOTAIR敲低 A375细胞系（p53野生型）用于HOTAIR突变和异种移植 MCF-7细胞系（p53野生型）用于PURB敲低验证 异种移植实验使用6周龄雌性裸鼠皮下注射2.0×10^6细胞
摘要
p53通过不同的转录靶点发挥其多种功能，但p53启动子特异性调控的精确机制在很大程度上仍不清楚。通过生化纯化，我们鉴定了嘌呤丰富元件结合蛋白B（PURB），一种双DNA/RNA结合蛋白，它以依赖于p53乙酰化状态的方式作为p53的转录共抑制因子。PURB在人类癌症中过表达，其敲低诱导p53依赖的p21激活，但对其他主要启动子如PUMA和MDM2没有影响。与其他p53共抑制因子相比，PURB能识别p21启动子上独特的DNA元件，该元件的缺失不影响p53介导的转激活，但消除了p53将PURB招募到p21启动子进行抑制的能力。机制上，PURB需要与长链非编码RNA（lncRNA）HOX转录反义RNA（HOTAIR）进行序列特异性结合以发挥其抑制功能。反过来，HOTAIR直接与EZH2相互作用，并通过PURB-HOTAIR复合物桥接，p53能够将EZH2组蛋白甲基转移酶招募到靶启动子上进行转录抑制。对p53靶标的进一步分析揭示了几个可能作为PURB结合靶标的启动子，表明这种PURB依赖的启动子特异性调控机制可能不仅限于p21。这些数据建立了一种lncRNA介导的p53转录序列特异性调控模式，并揭示了一种先前未预料到的通过PURB-HOTAIR复合物识别的顺式调控元件介导的乙酰化调控启动子特异性机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- p53如何通过启动子特异性调控选择性激活或抑制其靶基因？
- 核心机制
- PURB作为p53的转录共抑制因子，依赖p53乙酰化状态结合p53 C端结构域；PURB通过识别p21启动子上的顺式调控元件（PMS）被p53招募，并通过序列特异性结合长链非编码RNA HOTAIR，进而招募EZH2组蛋白甲基转移酶至靶启动子，增加H3K27me3水平，实现转录抑制。
- 主要证据
- 生化纯化、免疫共沉淀、体外结合实验、ChIP、CLIP、RNA-seq、CRISPR敲除、异种移植等实验证明PURB和HOTAIR对p53依赖的p21激活及肿瘤生长的抑制作用。
- 研究意义
- 揭示了lncRNA介导的p53转录序列特异性调控新机制，以及乙酰化通过顺式调控元件调控启动子特异性转录的机制，为癌症治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PURB-p53相互作用及乙酰化调控
确认PURB与p53的相互作用，并测试p53乙酰化状态对相互作用的影响
通过免疫共沉淀、GST pull-down、体外肽段结合实验验证相互作用，并使用乙酰化模拟突变体及乙酰化肽段测试乙酰化对结合的影响。
PURB功能研究及肿瘤抑制
评估PURB敲低或敲除对p53靶基因和细胞增殖的影响
使用siRNA和CRISPR-Cas9敲低或敲除PURB，检测p21、PUMA、MDM2表达及细胞增殖，并建立异种移植模型。
鉴定HOTAIR为PURB的功能性RNA伴侣
识别PURB结合的lncRNA并验证其在抑制p53靶基因中的作用
通过CLIP-seq鉴定PURB结合的lncRNA，使用ASO敲低HOTAIR检测p21表达，并进行体外结合实验和荧光素酶报告基因分析。
HOTAIR-PURB相互作用的功能验证
验证HOTAIR与PURB的相互作用对p53调控和肿瘤生长的影响
通过CRISPR-Cas9在A375细胞中删除HOTAIR中PURB结合序列，检测p21表达和肿瘤生长。
机制研究：PURB-HOTAIR-EZH2复合物
阐明PURB-HOTAIR复合物如何调控p53靶基因转录
通过CLIP、Co-IP、体外结合实验、ChIP检测EZH2和H3K27me3在p21启动子的富集，并测试HOTAIR结构突变的影响。
鉴定顺式调控元件PMS
确定PURB特异招募到p21启动子的DNA序列元件
使用MEME分析p21、MDM2、PUMA启动子序列，鉴定PMS，并通过体外结合、ChIP和报告基因验证其功能。
验证机制的普遍性
评估PURB依赖的启动子特异性调控是否适用于其他p53靶基因
通过RNA-seq和qPCR分析PURB敲低后的差异表达基因，并通过MEME和ChIP验证这些基因启动子上的PMS和PURB招募。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 多西环素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 阿霉素 | Sigma-Aldrich | 25316-40-9 |
| 曲古抑菌素A | -- | -- | |
| 烟酰胺 | -- | -- | |
| 基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000150 |
| 质粒构建 | QuickChange XL定点突变试剂盒 | Agilent | 200516 |
| siRNA敲低 | SMARTpool siRNA | Dharmacon | -- |
| 反义寡核苷酸敲低 | 反义寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | -- |
| 蛋白质印迹 | anti-Vinculin抗体 | Sigma-Aldrich | V9131 |
| anti-PURB抗体 | Bethyl Laboratories | A303-650A | |
| anti-PURB抗体 | Proteintech | 18128-1-AP | |
| anti-p53抗体（DO-1） | Santa Cruz Biotechnology | sc-126 | |
| anti-p53抗体（FL393） | Bioss | bs-8687R | |
| anti-p21抗体 | Cell Signaling Technology | 2947 | |
| anti-PUMA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28226 | |
| anti-MDM2抗体 | Millipore | OP-145 | |
| anti-Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| anti-HA抗体 | Roche | 11867423001 | |
| anti-MYC抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| anti-H3K27me3抗体 | Abcam | ab6002 | |
| anti-EZH2抗体 | Cell Signaling Technology | 3147 | |
| HRP标记的二抗 | SouthernBiotech | -- | |
| 蛋白质纯化 | 链霉亲和素磁珠 | Cytiva | GE17-5113-01 |
| 抗S蛋白琼脂糖 | Millipore | 69704 | |
| HA亲和磁珠 | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| M2 Flag磁珠 | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| GST结合树脂 | Novagen | 70541 | |
| RNA检测 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| SuperScript IV VILO反转录预混液 | Invitrogen | -- | |
| Turbo DNA酶 | Invitrogen | AM2238 | |
| RNA酶抑制剂 | -- | -- | |
| 体外转录RNA标记 | MEGAshortscript T7转录试剂盒 | Invitrogen | AM1354 |
| 生物素标记UTP | Thermo Fisher | AM8450 | |
| α-32P UTP | Perkin Elmer | BLU007H250UC | |
| DNA标记 | Pierce生物素3'末端DNA标记试剂盒 | Thermo Fisher | 89818 |
| CRISPR | TrueCut Cas9蛋白v2 | Invitrogen | A36498 |
| TrueGuide合成引导RNA | Invitrogen | A35526 | |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测 | Promega | E1910 |
| GloMax Discover酶标仪 | Promega | -- | |
| BrdU染色 | 5-溴脱氧尿苷 | BD Biosciences | 550891 |
| anti-BrdU抗体 | Thermo Fisher Scientific | B35128 | |
| Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | A27023 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 显微镜检查 | Olympus IX51显微镜 | Olympus | -- |
| ChIRP | Dynabeads MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 65001 |
| 生物素化反义寡核苷酸 | Sigma-Aldrich | 03-312M | |
| ChIP | 蛋白A琼脂糖 | Millipore | 16-157 |
| 蛋白质印迹 | GelCode Blue染色剂 | Thermo Fisher | 24592 |
| 蛋白质纯化 | 生物素 | -- | -- |
| Flag多肽 | Sigma-Aldrich | F3290 | |
| HA多肽 | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| 细胞培养 | 成纤维细胞生长培养基 | Sigma-Aldrich | C-23010 |
| RNA-seq文库制备 | Swift Biosciences文库制备试剂盒 | Swift Biosciences | R1024 |
| 蛋白质印迹 | 预制SDS-PAGE凝胶 | Invitrogen | XP0420 |
| 蛋白质分析 | Bradford蛋白浓度测定 | Bio-Rad | -- |
| 基因组编辑验证 | Sanger测序 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基成分、血清浓度、抗生素浓度、培养温度、CO2浓度 阅读提示：Methods - Cell culture, stable lines and reagent treatment |
| 药物处理 | 阿霉素浓度（0.2 μg ml−1）、TSA浓度（1 μM）、NAM浓度（5 mM）、处理时间 阅读提示：Methods - Cell culture, stable lines and reagent treatment |
| 转染 | 质粒用量、siRNA用量、ASO用量、转染试剂类型、转染时间 阅读提示：Methods - Plasmids, siRNAs, ASOs and transfection |
| 蛋白质印迹 | 抗体稀释比例、二抗稀释比例、上样量 阅读提示：Methods - Western blot and antibodies |
| ChIP | 甲醛固定时间、超声条件、抗体量、洗涤条件 阅读提示：Methods - ChIP |
| CLIP | UV交联剂量（400 mJ/cm2）、RNase抑制剂浓度、洗涤条件 阅读提示：Methods - UV CLIP |
| 异种移植模型 | 小鼠品系、周龄、性别、细胞接种数量、Matrigel比例、肿瘤测量时间 阅读提示：Methods - Animals |
| 荧光素酶报告基因实验 | 报告基因质粒用量、内参质粒用量、转染时间、检测时间 阅读提示：Methods - Luciferase assay |
| CRISPR-Cas9基因敲除 | Cas9蛋白、sgRNA序列、转染时间、单克隆筛选方法 阅读提示：Methods - CRISPR–Cas9 system-mediated gene ablation |