鉴定Nat10为异染色质相关蛋白
筛选mESCs中与异染色质相关的蛋白质，以发现新的调控因子。
通过H3K9me3抗体免疫沉淀结合质谱（IP-MS）鉴定异染色质相关蛋白，并与已发表数据比较；同时通过Flag-Nat10 IP-MS鉴定Nat10相互作用蛋白，并通过免疫荧光和Co-IP验证定位与相互作用。
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Nat10通过mRNA胞苷乙酰化维持小鼠胚胎干细胞多能性和2细胞样状态的稳态
Nat10 maintains the homeostasis of pluripotent and 2-cell-like states in mouse embryonic stem cells through mRNA cytidine acetylation.
实验完整度
高包含体外细胞模型（mESCs）和多种组学验证（RNA-seq、acRIP-seq、ChIP-seq），并进行了功能获得与缺失及回补实验，验证了机制。
主要模型
E3和E14小鼠胚胎干细胞系 诱导性Nat10敲低mESCs Nat10过表达mESCs
重点核对
细胞系：E14 mESCs，培养于0.2%明胶上 Nat10敲低：PiggyBac介导的诱导型人工miRNA，经多西环素（1 μg/ml）处理48小时诱导敲低 2C样细胞比例：通过Zscan4免疫荧光计数，对照为3.7%，敲低后升至8.5% RNA稳定性实验：放线菌素D（5 μg/ml）处理0、1、4、8小时 抑制剂处理：Remodelin（20 μM）处理三个传代
摘要
原始态小鼠胚胎干细胞（mESCs）的特征是处于可相互转换的多能性状态和全能性2细胞（2C）样状态的细胞混合群体。目前尚不清楚多能性状态如何维持而2C样状态如何被抑制。我们证明N-乙酰转移酶10（Nat10）通过mRNA修饰和稳定化来维持mESCs的多能性状态并抑制2C样状态。Nat10作为一种核仁蛋白，可能通过Ncl与异染色质间接相互作用。Nat10催化编码关键多能性基因（包括Oct4、Esrrb和Zfp42）的mRNA的N4-乙酰胞苷（ac4C）修饰，并增强其mRNA稳定性，从而增加其蛋白水平以维持多能性。此外，Nat10乙酰化并稳定异染色质修饰因子如Kap1的mRNA和蛋白，通过维持H3K9me3复合物来抑制2C基因。总之，这些发现强调了Nat10通过mRNA ac4C修饰在维持多能性网络和抑制2C样程序中的关键作用，为mESCs中多能性与全能性状态之间的转变提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 小鼠胚胎干细胞中多能性状态如何维持而2C样状态如何被抑制？
- 核心机制
- Nat10通过催化多能性基因（Oct4、Esrrb、Zfp42）和异染色质修饰因子Kap1的mRNA ac4C修饰，增强其稳定性；Kap1蛋白水平升高促进H3K9me3复合物维持，从而抑制2C基因表达。
- 主要证据
- Nat10敲低导致多能性基因下调、2C基因上调；acRIP-seq显示这些mRNA上ac4C峰减少，RNA稳定性实验证实其mRNA稳定性降低；ChIP-seq显示2C基因上H3K9me3减少；回补实验证实Nat10催化活性至关重要。
- 研究意义
- 揭示Nat10通过mRNA ac4C修饰平衡多能性与2C样状态的新机制，为理解多能性向全能性转变提供见解，并提示Remodelin处理可能是获得2CLCs的新方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Nat10维持多能性基因表达
确定Nat10对mESCs多能性维持的必要性。
构建诱导性Nat10敲低（KD）mESCs，通过RNA-seq、RT-qPCR和Western blot检测多能性基因表达变化。
检测Nat10对2C基因的抑制作用
探究Nat10是否抑制2C基因表达及2C样细胞比例。
在Nat10 KD和过表达（OE）mESCs中，通过RT-qPCR、Western blot、免疫荧光和GSEA分析2C基因表达和Zscan4阳性细胞比例。
分析ac4C修饰图谱
揭示Nat10敲低对mRNA ac4C修饰的影响及修饰靶点。
通过dot blot和acRIP-seq检测总RNA和mRNA上的ac4C水平，并进行生物信息学分析。
验证Nat10通过ac4C修饰稳定多能性基因mRNA
验证ac4C修饰对多能性基因mRNA稳定性的影响。
通过RNA稳定性实验（放线菌素D处理）检测Oct4、Esrrb、Rex1 mRNA的衰变速率，并比较Nat10 CON和KD mESCs。
验证Kap1是Nat10的靶点
探究Nat10是否通过调控Kap1来影响2C基因。
通过acRIP-seq、RT-qPCR、Western blot、RNA稳定性实验和ChIP-qPCR检测Kap1表达及H3K9me3在2C基因上的富集。
评估Nat10催化活性对Kap1和2C基因的作用
确定Nat10乙酰转移酶活性对Kap1和2C基因调控的必要性。
构建催化失活突变体Nat10G641E，在Nat10 KD mESCs中过表达野生型或突变体，检测Kap1 mRNA ac4C水平、Kap1和2C基因表达。
检测核仁/核糖体功能变化
探究Nat10敲低对核糖体生物发生和核仁结构的影响。
通过qPCR检测rRNA组分，GSEA分析核糖体生物发生相关基因，免疫荧光和SIM观察核仁结构。
探讨Nat10与LINE1-Ncl-Kap1复合物的关系
探究Nat10是否与LINE1-Ncl-Kap1复合物相互作用以调控2C基因。
通过分析LINE1元件上ac4C修饰、LINE1 ChIRP-seq数据、LINE1 KD RNA-seq数据以及Co-IP实验，检验Nat10与LINE1的相互调控关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Knock-out DMEM | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | -- | |
| 小鼠白血病抑制因子 | ESGRO, Chemicon | -- | |
| 明胶 | Sigma | -- | |
| 基因敲低 | 脂质体转染试剂3000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 多西环素 | -- | -- | |
| Western blot | NP40裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693132001 | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| Supersignal West Pico化学发光底物 | Millipore | -- | |
| 抗Nat10抗体 | Abcam | ab194297 | |
| 抗Actin抗体 | ABclonal | AC026 | |
| 抗Zscan4抗体 | Sigma-Aldrich | AB4340 | |
| 抗Kap1抗体 | GeneTex | GTX102226 | |
| 抗核仁素抗体 | CST | 14574S | |
| 抗Oct4抗体 | Santa Cruz | sc-5279 | |
| 抗Nanog抗体 | Abcam | ab80892 | |
| 抗Suv39h1抗体 | Abcam | ab283262 | |
| 抗Hp1α抗体 | Sigma-Aldrich | 05-689 | |
| 抗Setdb1抗体 | Abcam | ab107225 | |
| 抗Hp1γ抗体 | Novus | NBP2-15736 | |
| 抗H3K9me3抗体 | Abcam | ab8898 | |
| 抗H3K9ac抗体 | Abcam | ab4441 | |
| 抗H3K27ac抗体 | Abcam | ab177178 | |
| 抗H3抗体 | Abcam | ab1791 | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | GeneScript | A00098 | |
| 山羊抗小鼠IgG二抗 | GeneScript | A00160 | |
| Co-IP | 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 |
| 蛋白G琼脂糖树脂 | Yeasen | 36405ES08 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- | |
| M-MLV逆转录酶 | Thermo Scientific | 28025021 | |
| FS通用SYBR Green预混液 | Roche | -- | |
| iCycler MyiQ2检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 山羊血清 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | -- | |
| Axio Imager Z2荧光显微镜 | Zeiss | -- | |
| 山羊抗小鼠IgG FITC二抗 | Jackson | 115-095-003 | |
| 山羊抗兔IgG Alexa Fluor 594二抗 | Jackson | 111-585-003 | |
| 兔IgG Alexa Fluor 647 | Bioss | bs-0295P-AF647 | |
| RNA修饰检测 | Hybond-N+膜 | -- | -- |
| 抗ac4C抗体 | Abcam | ab252215 | |
| 亚甲蓝 | Sigma-Aldrich | -- | |
| RNA-seq | NEBNext第一链合成反应缓冲液 | NEB | -- |
| DNA聚合酶I | -- | -- | |
| 核糖核酸酶H | -- | -- | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| USER酶 | NEB | -- | |
| Phusion高保真DNA聚合酶 | NEB | -- | |
| Agilent Bioanalyzer 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| TruSeq PE簇生成试剂盒 | Illumina | -- | |
| ac4C-RIP-seq | GenSeq® ac4C RIP试剂盒 | GenSeq Inc. | -- |
| GenSeq®低起始量全RNA文库制备试剂盒 | GenSeq Inc. | -- | |
| NovaSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| ChIP-seq | H3K9me3抗体 | Abcam | ab8898 |
| RNA聚合酶II抗体 | Active Motif | 39497 | |
| Dynabeads M280磁珠 | Life Technologies | -- | |
| 抑制剂处理 | Remodelin | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：E14 mESCs；培养基成分：15% FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、非必需氨基酸、1 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM β-巯基乙醇、1000 U/ml mLIF、Knock-out DMEM；培养条件：37°C、5% CO2。 阅读提示：Methods - Cell culture |
| Nat10敲低 | 敲低方法：PiggyBac介导的诱导型人工miRNA（靶序列：TGAATTTCAAGACAGCTTTGG；AACACATTGACCCTGATCACC；ATGAGAAGCCACATAGAGAGC）；转染试剂：LIPOFECTAMINE 3000；筛选：嘌呤霉素；诱导条件：多西环素（1 μg/ml）处理48小时。 阅读提示：Methods - Generation of Nat10 KD ESCs |
| RNA稳定性实验 | 药物：放线菌素D（MCE, HY-17559）终浓度5 μg/ml；处理时间点：0、1、4、8小时；检测方法：RT-qPCR。 阅读提示：Methods - RNA stability assay |
| ac4C检测 | acRIP-seq：使用GenSeq® ac4C RIP Kit，RNA片段化约200 nt，抗体：anti-ac4C (Abcam, ab252215)；测序平台：Illumina NovaSeq。 阅读提示：Methods - Acetylated RNA immunoprecipitation sequencing (ac4C-RIP-seq) |
| ChIP实验 | 抗体：H3K9me3 (ab8898, Abcam) 和RNA Pol II (39497, Active Motif)；细胞量：约2×10^7；DNA片段大小：100-500 bp；测序：约20 million reads (125 bp)。 阅读提示：Methods - Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) |