动物分组与样本采集
建立高脂和低脂鸡模型，用于后续测序和验证。
158只三黄鸡饲养至100日龄，测量体重和腹脂重，计算腹脂率，选取12只分为高脂和低脂组，采集腹脂组织。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
EBF1的异常DNA甲基化调控鸡的脂肪生成
Abnormal DNA methylation of EBF1 regulates adipogenesis in chicken.
实验完整度
高包含WGBS测序、RNA-seq联合分析、细胞处理（5-Aza和甜菜碱）、过表达实验、油红O染色和Western blot等功能及机制验证。
主要模型
高脂和低脂鸡腹脂组织（各6只） 永生化鸡前脂肪细胞1（ICP-1）
重点核对
分组：根据腹脂率分为高脂和低脂组，各6只 细胞处理：5-Aza-dc和甜菜碱处理ICP-1细胞 EBF1过表达质粒转染剂量：12孔板1 µg/孔 分化诱导：15%胎牛血清和0.2%油酸诱导48小时 Western blot抗体稀释比：PPARγ和EBF1为1:1000，GAPDH为1:2000
摘要
背景：DNA甲基化影响基因表达，并参与包括脂肪生成在内的众多生物过程。它在包括家禽在内的许多动物物种中参与脂质生成。然而，DNA甲基化对鸡脂肪生成的影响仍不清楚。结果：根据腹脂率将12只100日龄鸡分为高脂和低脂组。随后，对其腹脂进行全基因组亚硫酸盐测序（WGBS），鉴定出1877个差异甲基化区域（DMR）基因，其中SLC45A3、EBF1、PLA2G15和ACAD9与脂质代谢相关。有趣的是，通过全面的RNA-seq分析发现，在低脂组中EBF1的DNA甲基化水平较低，而mRNA表达较高。细胞验证显示，5-氮杂胞苷（5-Aza）上调EBF1表达，而甜菜碱下调其表达。EBF1通过PPAR-γ通路促进永生化鸡前脂肪细胞1（ICP-1）的分化，从而影响鸡的脂肪生成。结论：WGBS和RNA-seq联合分析揭示了鸡腹脂组织中的48个差异甲基化基因（DMG）。值得注意的是，EBF1的DNA甲基化状态与其mRNA表达呈负相关。机制上，DNA甲基化调控EBF1表达，进而通过PPARγ通路介导ICP-1的分化。本研究为探讨DNA甲基化对鸡脂肪生成的影响提供了理论基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DNA甲基化在鸡腹脂沉积中的作用，特别是EBF1的DNA甲基化是否及如何影响鸡的脂肪生成。
- 核心机制
- EBF1的DNA甲基化水平与mRNA表达负相关；EBF1通过PPARγ通路抑制鸡前脂肪细胞分化，从而影响脂肪生成。
- 主要证据
- WGBS和RNA-seq联合分析显示EBF1在低脂组中甲基化水平较低、表达较高；细胞实验中，5-Aza-dc和甜菜碱处理证实DNA甲基化影响EBF1表达；过表达EBF1后油红O染色和qPCR显示分化相关基因PPARγ、C/EBPα等下调，Western blot显示PPARγ蛋白下降。
- 研究意义
- 本研究首次揭示EBF1的DNA甲基化与鸡脂肪沉积相关，为研究DNA甲基化对鸡脂肪生成的调控机制提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）
鉴定高脂和低脂鸡腹脂组织中的差异甲基化区域和基因。
提取12只鸡腹脂组织DNA，进行WGBS测序，分析差异甲基化区域和基因，并进行GO/KEGG富集分析。
RNA-seq联合分析
结合转录组数据，筛选与差异甲基化相关的差异表达基因。
利用前期RNA-seq数据，与WGBS结果联合分析，鉴定差异甲基化且差异表达的基因，并进行聚类、GO和PPI分析。
细胞水平验证EBF1表达受DNA甲基化调控
验证DNA甲基化是否影响EBF1表达。
用5-Aza-dc（去甲基化）和甜菜碱（甲基化供体）处理ICP-1细胞，检测EBF1 mRNA水平；并通过亚硫酸盐处理及Sanger测序确认甲基化状态。
EBF1对前脂肪细胞分化的功能验证
验证EBF1对鸡前脂肪细胞分化的影响。
用油酸诱导ICP-1分化，检测分化前后EBF1表达；过表达EBF1后，进行油红O染色，并检测分化标志基因和PPARγ蛋白水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
检测DNA甲基化
检测基因表达
检测蛋白表达
检测细胞分化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | DNA提取试剂盒 | TAKARA | -- |
| RNA提取 | MagZol试剂 | Magen | -- |
| RT-qPCR | PrimescriptTM RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | -- |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| ABI QuantStudio 5仪器 | Thermo Fisher | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 链霉素/青霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 质粒构建 | pcDNA3.1载体 | Promega | -- |
| 分化诱导 | 油酸 | Sigma | -- |
| 油红O染色 | 油红O染色液 | SolarBio | -- |
| Western blot | 抗PPARγ抗体 | BIOSS | bs-0530R |
| 抗EBF1抗体 | BIOSS | bs-12116R | |
| 抗GAPDH抗体 | BIOSS | bsm-33033M | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| SDS-PAGE凝胶 | EpiZyme | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物分组 | 分组依据为腹脂率，每组6只，共12只100日龄三黄鸡 阅读提示：见Materials and methods中的Animal experiment and ethics statement |
| WGBS测序 | 差异甲基化区域标准：平均甲基化差异大于25%，含至少4个CpG和1个DMC；测序深度约30× 阅读提示：见Materials and methods中的Whole-genome bisulfite sequence (WGBS)和Data analysis of differential methylation genes |
| 细胞处理 | 5-Aza-dc和甜菜碱浓度及处理时间未在正文明确说明 阅读提示：见Results中Methylation inhibits EBF1 expression...及相关图注 |
| 细胞分化诱导 | 分化诱导条件：15%FBS+0.2%油酸，诱导48小时 阅读提示：见Materials and methods中的Oil red O staining |
| EBF1过表达 | 转染剂量：12孔板1 µg/孔；转染后培养时间：油红O染色前48小时 阅读提示：见Materials and methods中的Cell culture and cell transfection和Oil red O staining |
| 蛋白检测 | Western blot抗体稀释比：PPARγ和EBF1为1:1000，GAPDH为1:2000 阅读提示：见Materials and methods中的Western blotting |