构建胚胎骨骼肌单细胞图谱
鉴定不同发育阶段和品种的骨骼肌细胞类型和异质性
对DH和TC的E10、E14、E18腿肌进行scRNA-seq，经质量控制获得59,639个高质量细胞，通过tSNE和UMAP聚类鉴定出6种主要细胞类型。
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单细胞RNA转录组揭示大恒肉鸡和藏鸡胚胎骨骼肌的不同发育轨迹
Single-cell RNA transcriptome uncovers distinct developmental trajectories in the embryonic skeletal muscle of Daheng broiler and Tibetan chicken.
实验完整度
高包含scRNA-seq细胞图谱、拟时序轨迹、基因开关分析、细胞通讯分析及免疫荧光验证等多层级证据。
主要模型
大恒肉鸡胚胎腿肌 藏鸡胚胎腿肌
重点核对
胚胎发育阶段：E10、E14、E18 性别：雄性胚胎 样本混合：每个品种每个阶段3个生物学重复混合 细胞质量：细胞活性>85%，碎片<4%，细胞聚集率<5%，总细胞数>10^5
摘要
不同鸡品种因选择性繁殖而表现出不同的肌肉表型，但人们对造成这种表型差异的分子机制知之甚少。骨骼肌由大量异质性细胞群体组成。细胞群体的分化和相互作用差异在骨骼肌表型差异中发挥关键作用。在本研究中，我们对大恒肉鸡（DH，培育品种）和藏鸡（TC，地方品种）在胚胎期（E）10、E14和E18的腿肌进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。构建了包含29,579个高质量细胞、代表6种不同细胞类型的鸡胚胎骨骼肌综合细胞图谱。通过拟时序轨迹分析构建了成肌细胞和纤维/脂肪祖细胞（FAPs）的分化轨迹。我们的结果揭示了两种鸡品种的3种成肌细胞亚型和5种FAPs亚型的不同发育轨迹和动态基因表达谱。与DH相比，TC表现出更早的胚胎肌生成和较少的成肌细胞。通过比较两个品种中基因的开关状态和开关时间，SNRPG、SNRPE、EIF4EBP1和HSP90AB1被认为是胚胎肌生成的潜在关键基因，而MYOG、MYBPH、APOA1和MGP在胚胎脂肪生成中起主导作用。细胞间相互作用网络显示，胚胎骨骼肌生长发育过程中存在强烈而复杂的细胞间通讯。这些发现揭示了TC和DH鸡骨骼肌发育分子机制的差异。我们的数据为更好地理解培育品种和地方品种之间的骨骼肌发育差异提供了依据，并为鸡的遗传育种提供了有价值的信息。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 不同鸡品种（培育品种DH和地方品种TC）骨骼肌表型差异的分子机制是什么？
- 核心机制
- 藏鸡表现出更早的胚胎肌生成和较少的成肌细胞，可能与肌卫星细胞增殖和分化的动态差异有关，包括MYF5、PAX7、MYOG、MYBPH等基因的差异表达。
- 主要证据
- 基于scRNA-seq构建的包含59,639个细胞的图谱，拟时序轨迹分析和基因开关分析显示TC比DH更早进入肌生成，且FAPs的脂肪生成也较早。
- 研究意义
- 为理解培育品种和地方品种骨骼肌发育差异提供新见解，并为鸡的遗传育种提供有价值信息。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
成肌细胞亚群分析及拟时序轨迹构建
探究成肌细胞亚群的分化轨迹和动态基因表达
对成肌细胞进行无监督聚类，鉴定3个亚型（卫星细胞、成肌细胞、肌细胞），利用Monocle进行拟时序分析，并分析沿轨迹的基因表达动态。
基因开关分析
识别在肌生成和脂肪生成过程中关键基因的激活和失活顺序
使用GeneSwitches包对拟时序轨迹上的基因表达进行二元化，通过逻辑回归计算开关时间点，比较两品种间开关状态差异。
细胞通讯分析
揭示胚胎骨骼肌发育中的细胞间配体-受体相互作用
利用CellChat包分析6种细胞类型间在三个发育阶段的配体-受体对，比较两品种间的通讯差异。
免疫荧光验证
验证scRNA-seq鉴定的细胞类型
对DH和TC的腿肌组织进行免疫荧光染色，检测成肌细胞和FAPs的标志基因（DCN、PAX7、PDGFRA、PRRX1、MYF5、MYOG）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞RNA测序 | 10x Genomics Chromium单细胞3'文库制备与凝胶微珠试剂盒v2 | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞分离 | 胶原酶I | -- | -- |
| 40微米尼龙细胞筛网 | -- | -- | |
| 免疫荧光染色 | DCN抗体 | Affinity Biosciences | DF6543 |
| PAX7抗体 | Affinity Biosciences | AF7584 | |
| PDGFRA抗体 | Affinity Biosciences | AF5489 | |
| PRRX1抗体 | Affinity Biosciences | DF4274 | |
| MYF5抗体 | Affinity Biosciences | DF4274 | |
| MYOG抗体 | Beijing Biosynthesis Biotechnology | Bs-3550r | |
| FITC标记的山羊抗兔IgG二抗 | Wuhan Servicebio Technology | GB22303 | |
| DAPI染色液 | Wuhan Servicebio Technology | G1012 | |
| 倒置荧光显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 实验动物 | 鸡胚来源：DH来自四川大恒家禽育种有限公司，TC来自茂县九鼎原生态畜禽养殖有限公司；孵化条件：37.5℃、55%湿度；胚胎性别：雄性；发育阶段：E10、E14、E18；样本混合：每个品种每个阶段3个生物学重复混合。 阅读提示：Methods中的Experimental animals |
| 细胞分离 | 消化条件：胶原酶I消化30分钟；过滤：40 μm筛网；质量评估：细胞活性>85%、碎片<4%、细胞聚集率<5%、总细胞数>10^5。 阅读提示：Methods中的Single-cell RNA-seq using 10 x Genomics |
| 单细胞测序 | 建库平台：10x Genomics；测序平台：Illumina NovaSeq 6000；比对参考基因组：GRCg6a；质量控制：基因和UMI数在均值±2个标准差内且线粒体基因比例<30%。 阅读提示：Methods中的Single-cell RNA-seq using 10 x Genomics及10 x sequencing data preprocessing |
| 免疫荧光 | 抗体稀释比：1:100；抗原修复：柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）97.5℃ 20分钟；封闭：3% BSA 40分钟；一抗孵育：4℃过夜；二抗孵育：37℃ 30分钟；DAPI染色：RT 10分钟。 阅读提示：Methods中的Immunofluorescence staining |
| 拟时序及基因开关分析 | 使用Monocle进行拟时序分析；使用GeneSwitches包；基因开关标准：|R2|>0.2且基因表达率>10%。 阅读提示：Methods中的Pseudotime analysis及GeneSwitches analysis |