筛选天然化合物库以鉴定上调MHC-I的化合物
鉴定能够上调乳腺癌细胞MHC-I表达的化合物。
使用Natural Compound set V（NCI）处理DCIS.com细胞（5 µM，48小时），通过免疫荧光检测MHC-I表达，初步筛选出Macbecin II、cassythicine和baccatin III进一步验证。
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实体瘤中Macbecin II上调MHC-I增强主动免疫治疗效果
MHC-I upregulation by macbecin II in the solid tumors potentiates the effect of active immunotherapy.
实验完整度
高包含体外细胞系筛选、抗原呈递和T细胞杀伤实验、体内小鼠肿瘤模型（E0771、B16-F1）以及机制研究（溶酶体降解），跨多个证据层级。
主要模型
乳腺癌细胞系DCIS.com和MCF10CA1a 小鼠乳腺癌细胞系E0771和4T1 小鼠黑色素瘤细胞系B16-Ova和B16-F1 E0771乳腺癌小鼠模型和B16-F1黑色素瘤小鼠模型
重点核对
Macbecin II处理剂量（0.1, 0.5, 5 µM）和处理时间（48小时） 动物实验中Macbecin II给药剂量（2 mg/kg）和给药时间（第0、8、15天） 体内实验中肿瘤细胞植入数量（200K cells）和植入方式（乳腺导管内注射） 联合治疗时疫苗IL2-ep13nsEV的给药方案（肌肉注射，每次50 μg）和抗PD-1的给药方案（腹腔注射，20 mg/kg）
摘要
我们旨在恢复包括乳腺癌和黑色素瘤在内的实体瘤表面的MHC-I表达，以重新获得对免疫治疗的敏感性并抑制转移进展。我们筛选了一个天然化合物库，并鉴定出Macbecin II作为一种试剂，可在浸润前和浸润性乳腺癌模型中上调MHC-I表达并诱导抗原依赖性细胞死亡。此外，我们采用主动免疫治疗，使用来自树突状细胞(DCs)的工程化小细胞外囊泡作为肿瘤疫苗(IL2-ep13nsEV)，与Macbecin II联合用于个性化乳腺癌治疗。我们发现Macbecin II诱导MHC-I依赖性抗原呈递，IL2-ep13nsEV与Macbecin II协同诱导细胞死亡、减少转移并增强免疫细胞浸润。此外，Macbecin II增强了抗PD-1免疫治疗抑制肿瘤生长和转移的效果。机制上，Macbecin II通过将其从溶酶体降解中拯救出来，在翻译后水平上调MHC-I表达。我们的发现揭示了Macbecin II在调节MHC-I表达和随后的抗原依赖性细胞死亡方面的强大功效。因此，将主动免疫治疗与Macbecin II联合是预防包括乳腺癌和黑色素瘤在内的实体瘤生长和进展的有效策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何恢复实体瘤（如乳腺癌）的MHC-I表达以增强免疫治疗效果并抑制转移？
- 核心机制
- Macbecin II通过抑制溶酶体降解途径稳定MHC-I蛋白，从而上调MHC-I表达，增强抗原呈递和CD8 T细胞介导的肿瘤杀伤。
- 主要证据
- 在乳腺癌和黑色素瘤细胞系中，Macbecin II处理显著上调MHC-I表面表达；在体内模型中，Macbecin II与IL2-ep13nsEV疫苗或抗PD-1联合治疗显著抑制肿瘤生长和肺转移，并增加肿瘤浸润淋巴细胞。
- 研究意义
- 该研究提出联合Macbecin II与主动免疫治疗（如肿瘤疫苗和免疫检查点阻断）可能是预防和治疗乳腺癌（包括早期DCIS）以及可能其他实体瘤的有效策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Macbecin II在不同乳腺癌细胞中上调MHC-I/II
确认Macbecin II在多种乳腺癌细胞中的效应。
用不同浓度Macbecin II（0.1, 0.5 µM）处理DCIS.com、MCF10CA1a、E0771、4T1细胞48小时，通过流式细胞术检测MHC-I和MHC-II表面表达，并通过Western blot验证蛋白水平。
检测抗原呈递和T细胞介导的杀伤
确定Macbecin II是否增强抗原呈递并促进抗原依赖性细胞死亡。
使用B16-Ova细胞和OT-1 T细胞共培养系统，检测H-2Kb/Ova呈递、IFN-γ和TNF-α分泌、CD69表达以及细胞毒性。
体外评估疫苗（IL2-ep13nsEV）与Macbecin II的协同作用
评估Macbecin II是否能增强IL2-ep13nsEV诱导的肿瘤细胞杀伤。
用DCIS.com裂解物制备IL2-ep13nsEV，与HLA匹配的PBMCs共培养，然后与DCIS.com或MCF10CA1a细胞在Macbecin II存在下共培养，检测细胞活力和联合指数。
体内评估IL2-ep13nsEV与Macbecin II联合治疗
在体内模型中验证联合治疗对肿瘤生长和转移的影响。
使用E0771或B16-F1小鼠模型，通过导管内或皮下注射肿瘤细胞，给予IL2-ep13nsEV和/或Macbecin II，测量肿瘤体积、重量、肺转移灶，并通过流式分析肿瘤浸润淋巴细胞。
评估抗PD-1与Macbecin II联合治疗
测试Macbecin II是否能增强抗PD-1免疫检查点阻断的效果。
在E0771小鼠模型（导管内注射）和MMTV-PyVT自发肿瘤模型中，使用抗PD-1和/或Macbecin II治疗，评估肿瘤生长、重量、转移和T细胞浸润。
机制研究：MHC-I上调的分子机制
阐明Macbecin II上调MHC-I的分子机制。
检测MHC-I mRNA水平、蛋白质稳定性（使用环己酰亚胺）、蛋白酶体和溶酶体抑制剂（MG-132、巴弗洛霉素）的作用，以及C381（溶酶体酸化促进剂）的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875093 |
| DMEM培养基 | Gibco | 11965092 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000044 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 重组小鼠GM-CSF | Peprotech | 315-03 | |
| 重组人GM-CSF | Peprotech | 212-12 | |
| 重组人IL-4 | Peprotech | -- | |
| 疫苗制备 | 脂多糖溶液 | Thermo Fisher Scientific | 00-4976-93 |
| 双环二鸟苷酸 | -- | -- | |
| IL2-MFG-E8融合蛋白质粒 | System Biosciences | -- | |
| pPAX2包装质粒 | -- | -- | |
| pMD2.G包膜质粒 | -- | -- | |
| ExoQuick试剂盒 | -- | -- | |
| 流式分析 | Zombie Aqua固定活性检测试剂盒 | BioLegend | 423101 |
| 抗MHC-I抗体 (HLA ABC) | Abcam | ab134189 | |
| 山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor) | Abcam | ab150077 | |
| MHC II抗体 | BioLegend | 307602 | |
| H-2Kb-ova抗体 | BioLegend | 141603 | |
| PE抗小鼠CD4抗体 | BioLegend | 100407 | |
| APC抗小鼠CD8a抗体 | BioLegend | 100711 | |
| FITC抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | 100203 | |
| PE/Cyanine7抗小鼠IFN-γ抗体 | BioLegend | 505825 | |
| CD69抗体 | BioLegend | 104507 | |
| PE标记小鼠H-2Kb&B2M&OVA (SIINFEKL)四聚体蛋白 | ACROBiosystems | H2A-MP2H7-25ug | |
| Western blot | GAPDH抗体 | CST | 5174S |
| MHC-I抗体 | Invitrogen | 11-5958-80 | |
| PD-L1 (D4H1Z)兔单克隆抗体 | CST | 60475 | |
| 磷酸化eIF2α抗体 | CST | 3398T | |
| Laemmli上样缓冲液 | Bio-Rad | 161-0737 | |
| SuperSignal™ West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Scientific | 34580 | |
| 细胞毒性实验 | CellTiter 96® AQueous One Solution细胞增殖检测试剂盒 (MTS) | Promega | G3582 |
| 结晶紫 | Fisher | S25275B | |
| InVivoMAb抗小鼠PD-1抗体 | Bioxcell | CD279 | |
| InVivoMAb抗小鼠MHC I类抗体 | Bioxcell | BE0077 | |
| 抗HLA-DR抗体 | Sino Biologicals | 105342-T40 | |
| T细胞激活 | CD3/CD28激活试剂盒 | ThermoFisher | 10971 |
| 小鼠T细胞激活/扩增试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-093-627 | |
| T细胞分离 | 小鼠CD8a+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi | 130-095-236 |
| 基因表达 | RNA分离试剂盒 | Zymo | R2072 |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708890 | |
| SYBR Green预混液 | -- | -- | |
| 蛋白定量 | Quick Start™ Bradford蛋白质检测试剂盒 | Bio-Rad | 5000201 |
| 生化检测 | AST活性检测试剂盒 | MilliporeSigma | MAK055-1KT |
| 免疫组织化学 | ImmPACT® DAB EqV底物试剂盒，过氧化物酶 (HRP) | Vector Labs | SK-4103 |
| 细胞因子检测 | 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | RayBiotech | ELM-TNFa-1 |
| 药物处理 | Macbecin II | -- | -- |
| MG132 | Adooq Bioscience | A11043 | |
| 巴弗洛霉素 | Adooq Bioscience | A11961 | |
| C381 | -- | -- | |
| OVA肽 | GenScript | RP10611 | |
| 细胞培养 | 红细胞裂解缓冲液 (10X) | BioLegend | 420301 |
| 胞内染色透化洗涤缓冲液 | BioLegend | 421002 | |
| 支原体去除剂 (MRA) | MP Biomedical | 3050044 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 11965092 | |
| 仪器 | BD FACS Canto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 荧光酶标仪 | -- | -- | |
| FEI Tecnai BioTwin透射电子显微镜 | FEI | -- | |
| NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Amersham成像仪 | GE Healthcare | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（如ATCC）、培养基类型（RPMI 1640、DMEM）、FBS浓度（10%）、GM-CSF浓度（20 ng/mL）、培养时间（6天） 阅读提示：Methods - Cell lines and culture methods |
| 化合物筛选与处理 | Macbecin II浓度（0.1-5 µM）、处理时间（48小时）、天然化合物库筛选浓度（5 µM） 阅读提示：Figure 1 legend、Methods - Natural compound library screening |
| 流式细胞术 | 抗体种类、浓度（例如1:500）、孵育时间（30分钟）、温度（室温）、细胞处理（包括固定、透化） 阅读提示：Methods - Flow cytometry |
| T细胞激活与细胞毒性实验 | T细胞来源（脾脏）、激活方法（CD3/CD28微珠）、共培养比例（E:T=10:1）、Macbecin II浓度（0.1-0.5 µM）、处理时间（48小时）、细胞种植密度（500 cells/well） 阅读提示：Methods - T-cell activation and cytotoxicity assay |
| 体内动物实验 | 小鼠品系（C57BL/6）、细胞植入方式（导管内或皮下）、细胞数量（200K或2×10^5）、Macbecin II剂量（2 mg/kg）、给药时间（第0、8、15天）、疫苗剂量（50 μg）和抗PD-1剂量（20 mg/kg） 阅读提示：Methods - Animal experiments |
| 溶酶体降解机制 | 抑制剂浓度（MG-132 10 µM、巴弗洛霉素100 nM、C381 30 µM）、环己酰亚胺浓度（50 µg/mL）、处理时间（12小时） 阅读提示：Figure 6 legend |