临床样本中E-cad和YAP表达分析
探究E-cad和YAP在结直肠癌组织中的表达差异及其与预后的相关性。
收集60例结直肠癌患者的肿瘤和癌旁组织，通过免疫组织化学染色检测E-cad和YAP的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
E-钙黏蛋白通过Hippo信号通路抑制人结直肠癌细胞的增殖和迁移
E-cadherin inhibits the proliferation and migration of human colorectal cancer cells through Hippo signaling pathway.
实验完整度
中包含体外细胞实验、临床组织样本验证及机制研究，但缺乏体内动物模型验证，实验完整度中等。
主要模型
人结直肠癌细胞系HCT116 人结直肠癌细胞系SW480 患者肿瘤组织样本（60例）
重点核对
细胞系：HCT116和SW480，培养条件：37°C、5% CO2 E-cad沉默和恢复：sh-E-cad慢病毒转染和E-cad过表达质粒转染，目标序列为5'-ATTTTAAAGGT-TAAAGTAGCCTTCAAGAGAGGCTACTTTAACCTT-TAAAAT-3' 细胞增殖检测：CCK-8实验，2000细胞/孔，96孔板，6个复孔 细胞迁移检测：Transwell实验和划痕愈合实验，分别使用20000细胞/孔和1000000细胞/孔 凋亡检测：Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术
摘要
E-钙黏蛋白（E-cad）是拯救上皮间质转化的关键调控因子，并参与多种恶性肿瘤的发生。然而，E-cadherin调控结直肠癌肿瘤转移的机制仍不清楚。我们建立了sh-E-cad（通过短发夹RNA沉默）和rescue-E-cad（通过E-cad质粒转染过表达）结直肠癌细胞系，以在体外研究E-cad在结直肠癌中的作用。采用免疫组织化学、克隆形成实验、划痕愈合实验、CCK-8实验、流式细胞术、Transwell实验、实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法来研究E-cad参与结直肠癌进展的潜在机制。在结直肠癌组织中，E-cad表达显著降低，而YAP表达显著升高。沉默E-cad显著增强了结直肠癌细胞的克隆形成能力，而恢复E-cad表达后可降低这种能力。Transwell实验表明，E-cad低表达增强了细胞迁移，这一发现与划痕愈合实验结果一致。CCK-8结果显示，沉默E-cad促进了结直肠癌细胞的增殖。重要的是，我们发现E-cad影响细胞凋亡而非细胞周期。对Hippo信号通路相关因子的分析显示，沉默E-cad导致MST1/2和LATS1/2表达显著降低，YAP磷酸化水平降低，而YAP表达显著增加。此外，免疫荧光证实了YAP的核转位。我们的研究表明，E-cad通过Hippo信号通路调节结直肠癌的恶性进展，为结直肠癌治疗提供了潜在的新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- E-cadherin如何调控结直肠癌的恶性进展，其机制是否涉及Hippo信号通路？
- 核心机制
- E-cadherin通过激活Hippo信号通路（上调MST1/2和LATS1/2表达，促进YAP磷酸化，抑制YAP核转位）抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移。
- 主要证据
- 在结直肠癌细胞系HCT116和SW480中沉默E-cad后，细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力增强，凋亡减少；恢复E-cad表达则逆转这些效应。同时，Western blot和RT-PCR显示Hippo通路关键分子MST1/2、LATS1/2表达及YAP磷酸化水平降低，免疫荧光和核质分离实验证实YAP核转位增加。
- 研究意义
- 研究阐明E-cadherin通过Hippo信号通路抑制结直肠癌进展，为结直肠癌的靶向治疗提供潜在策略，并有助于早期诊断和预后评估。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建E-cad沉默和恢复表达的结直肠癌细胞系
建立E-cad低表达和恢复表达的细胞模型，以研究E-cad在结直肠癌细胞中的功能。
使用慢病毒载体pLKO.1携带sh-E-cad转染HCT116和SW480细胞，建立E-cad稳定敲低细胞系；随后在敲低细胞中转染E-cad过表达质粒，构建恢复表达细胞系。
E-cad对细胞增殖和克隆形成的影响
检测E-cad表达变化对结直肠癌细胞增殖能力的影响。
通过CCK-8实验和克隆形成实验检测E-cad沉默和恢复后的细胞增殖变化。
E-cad对细胞迁移和侵袭的影响
评估E-cad对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的作用。
通过划痕愈合实验和Transwell实验检测E-cad沉默和恢复后的细胞迁移和侵袭变化。
E-cad对细胞周期和凋亡的影响
探究E-cad对结直肠癌细胞周期分布和凋亡的影响。
使用流式细胞术检测细胞周期（PI染色）和细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI双染）。
E-cad对Hippo信号通路的影响
验证E-cad是否通过调控Hippo信号通路发挥作用。
通过Western blot和RT-qPCR检测MST1/2、LATS1/2、YAP及磷酸化YAP的表达水平。
E-cad对YAP核转位的影响
确认E-cad对YAP核转位的影响，以阐明其调控机制。
通过核质分离和Western blot检测细胞核内YAP水平，并通过免疫荧光共定位分析E-cad和YAP的分布。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | E-cad抗体 | Abcam | ab231303 |
| YAP1抗体 | Abcam | ab52771 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG二抗 | Bioss Technology Co., Ltd. | BS-0295G-HRP | |
| DAB底物 | Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9017 | |
| 显微镜（Olympus BX53） | Olympus | BX53 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11995065 |
| McCoy's 5A培养基 | Pricella Biotechnology Co., Ltd. | PM150710 | |
| 胎牛血清 | Excell Bio | FSD500 | |
| 细胞转染 | E-cad人源标签CDS克隆慢病毒颗粒 | EnvirusTM | -- |
| E-cad靶向短发夹RNA | Sangon Biotech | -- | |
| 非eGFP-荧光素酶质粒 | Sangon Biotech | -- | |
| Transwell实验 | 基质胶 | Corning Inc. | 354230 |
| Transwell小室 | Corning Inc. | 3413 | |
| 流式细胞术 | PI/RNase染色液 | -- | -- |
| FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C1052 | |
| 流式细胞仪（Attune NxT） | Thermo Fisher Scientific | Attune NxT | |
| RT-qPCR | 细胞/组织总RNA提取试剂盒V2 | -- | RC112 |
| HiScript lll第一链cDNA合成试剂盒 | -- | R312 | |
| Taq Pro通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q712 | |
| CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad Laboratories | CFX96 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0020 |
| 抗E-cad抗体 | Abcam | ab231303 | |
| 抗p-YAP1抗体 | Abcam | ab76252 | |
| 抗YAP1抗体 | Abcam | ab52771 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Abcam | Ab1791 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| 化学发光成像仪（JP-K6000） | -- | JP-K6000 | |
| 免疫荧光 | 抗E-cadherin抗体 | Abcam | ab231303 |
| 抗YAP1抗体 | Abcam | ab52771 | |
| Alexa Fluor 488荧光二抗 | ThermoFisher | A-11066 | |
| Alexa Fluor 594荧光二抗 | Abcam | Ab150080 | |
| 共聚焦显微镜（Leica TCS SP8） | Leica | TCS SP8 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | 患者样本量（60例），肿瘤和癌旁组织处理（石蜡包埋、切片厚度5mm），抗体稀释比例（E-cad 1:200，YAP1 1:200），孵育条件（4°C过夜） 阅读提示：Materials and Methods: Immunohistochemistry assay; Figure 1 legend |
| 细胞培养 | 细胞系（HCT116、SW480、293T），培养基（DMEM或McCoy's 5A，添加10% FBS），培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines |
| 基因敲低和过表达 | shRNA靶序列，转染时间（24h），感染时间（8h），筛选药物（嘌呤霉素）及其浓度（文中未明确说明） 阅读提示：Materials and Methods: Lentivirus transduction and generation of stable cell lines |
| 细胞增殖和克隆形成 | 细胞接种密度（CCK-8: 2000细胞/孔；克隆形成: 2000细胞/孔），培养时间（克隆形成2周），检测波长（450nm），重复数（6个复孔） 阅读提示：Materials and Methods: CCK-8 testing, Clone formation testing |
| 细胞迁移和侵袭 | Transwell小室孔径（文中未明确说明），基质胶稀释比例（1:4），细胞数（20000细胞/孔），孵育时间（24h）；划痕实验细胞密度（1000000细胞/孔），划痕后观察时间（0h和24h） 阅读提示：Materials and Methods: Transwell assay, Wound healing testing |
| 细胞周期和凋亡 | PI染色浓度（未明确），Annexin V-FITC和PI孵育时间（15min），流式细胞仪型号（Attune NxT） 阅读提示：Materials and Methods: Flow cytometry |
| Hippo通路蛋白和mRNA检测 | 抗体稀释比例（E-cad 1:1000，p-YAP1 1:10000，YAP1 1:5000，Histone H3 1:5000，GAPDH 1:10000），RT-qPCR引物序列，内参基因（GAPDH） 阅读提示：Materials and Methods: Western blot, Real-time PCR |
| YAP核转位验证 | 核质分离试剂盒步骤（文中详细描述），免疫荧光抗体稀释比例（E-cad 1:50，YAP1 1:100），共定位分析软件（Fiji） 阅读提示：Materials and Methods: Immunofluorescence, Nuclear and cytoplasmic separation |