酸和胆汁盐诱导HET-1A细胞反流性食管炎模型建立
模拟胃食管反流环境，建立反流性食管炎细胞模型。
使用1 mM HCl调节培养基至pH4，并联合0.25 mM甘氨鹅脱氧胆酸、0.1 mM牛磺胆酸钠、0.3 mM甘氨脱氧胆酸钠和0.1 mM牛磺脱氧胆酸钠处理HET-1A细胞6小时。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
miR-223-3p通过靶向NLRP3炎症小体抑制反流性食管炎的机制研究
Investigation of the mechanism by which miR-223-3p inhibits reflux esophagitis through targeting the NLRP3 inflammasome.
实验完整度
中利用HET-1A细胞模型，包含过表达/敲低miR-223-3p及NLRP3回补实验，结合qPCR、Western blot、流式细胞术和双荧光素酶报告验证功能与机制。
主要模型
人食管上皮细胞系HET-1A 酸和胆汁盐诱导的反流性食管炎细胞模型
重点核对
HET-1A细胞系来源：Hunan Fenghui Biotechnology，CL0139 酸和胆汁盐处理条件：1 mM HCl（pH4）联合0.25 mM甘氨鹅脱氧胆酸、0.1 mM牛磺胆酸钠、0.3 mM甘氨脱氧胆酸钠、0.1 mM牛磺脱氧胆酸钠处理6小时 miR-223-3p过表达和敲低序列及转染浓度（50 nM） NLRP3过表达载体构建及稳定细胞系筛选 双荧光素酶报告基因验证miR-223-3p与NLRP3直接靶向关系
摘要
背景：反流性食管炎是一种常见的胃肠道疾病，以显著的炎症反应为特征。NLRP3炎症小体在炎症中起关键作用，且miR-223-3p被发现通过靶向NLRP3 mRNA抑制其表达。本研究旨在进一步探讨miR-223-3p通过靶向NLRP3炎症小体抑制反流性食管炎的机制。方法：构建反流性食管炎细胞模型，评估miR-223-3p和NLRP3的表达水平。采用过表达和抑制技术研究miR-223-3p对NLRP3炎症小体的影响。使用qPCR和Western blot检测相关炎症因子的表达，流式细胞术评估细胞凋亡和细胞周期变化。结果：研究发现，在反流性食管炎模型中，miR-223-3p显著下调，而NLRP3及其下游炎症因子显著上调。过表达miR-223-3p显著抑制NLRP3表达，减少炎症因子释放，降低细胞凋亡，促进细胞周期进展，并增强细胞活力。过表达NLRP3逆转了miR-223-3p的这些保护作用，进一步证实miR-223-3p通过抑制NLRP3炎症小体激活来减轻炎症。结论：本研究证明miR-223-3p通过靶向NLRP3炎症小体在减少反流性食管炎的炎症和细胞损伤中发挥关键作用。这些发现为反流性食管炎的治疗提供了新的见解和潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- miR-223-3p通过靶向NLRP3炎症小体在反流性食管炎中发挥何种作用及机制？
- 核心机制
- miR-223-3p直接靶向NLRP3 mRNA，抑制NLRP3炎症小体的组装和激活，从而减少下游炎症因子（如IL-1β、IL-18）的释放，抑制细胞凋亡，促进细胞周期进展，增强细胞活力。
- 主要证据
- 在酸和胆汁盐诱导的HET-1A细胞模型中，miR-223-3p表达下调，NLRP3及相关蛋白表达上调；过表达miR-223-3p显著抑制NLRP3炎症小体激活及炎症因子分泌，减少凋亡，而NLRP3过表达逆转这些保护作用；双荧光素酶报告实验证实miR-223-3p直接靶向NLRP3。
- 研究意义
- 本研究为miR-223-3p作为反流性食管炎的潜在治疗靶点提供了实验依据，并为该病的治疗提供了新思路和方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测模型细胞中miR-223-3p和NLRP3表达变化
观察在反流性食管炎模型中miR-223-3p和NLRP3炎症小体通路的变化。
通过qPCR检测miR-223-3p和NLRP3相关RNA表达，Western blot检测NLRP3、caspase-1和GSDMD蛋白水平。
miR-223-3p过表达和敲低功能实验
验证miR-223-3p对酸和胆汁盐诱导损伤的保护作用。
转染miR-223-3p模拟物、抑制剂及阴性对照，分别比较细胞增殖（EDU）、凋亡（流式）、细胞周期（流式）及IL-1β和IL-18分泌（ELISA）的变化。
验证miR-223-3p对NLRP3炎症小体激活的调控
验证miR-223-3p是否通过直接靶向NLRP3调控其炎症小体激活。
检测过表达和敲低miR-223-3p后NLRP3、ASC、caspase-1等蛋白表达变化；通过双荧光素酶报告实验验证miR-223-3p与NLRP3的直接结合。
NLRP3过表达回补实验
验证NLRP3过表达是否逆转miR-223-3p的保护作用。
在miR-223-3p过表达基础上共转染NLRP3过表达载体，检测细胞凋亡、细胞周期、细胞活力及NLRP3相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HET-1A细胞系培养条件：10% FBS，37°C，5% CO2，培养基每2天更换一次；细胞消化使用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA。 阅读提示：Methods：Cell culture |
| 反流性食管炎细胞模型建立 | 酸和胆汁盐处理浓度及时间：1 mM HCl（pH4），0.25 mM甘氨鹅脱氧胆酸、0.1 mM牛磺胆酸钠、0.3 mM甘氨脱氧胆酸钠、0.1 mM牛磺脱氧胆酸钠，处理6小时。 阅读提示：Methods：Experimental grouping，Table 1 |
| 细胞转染 | miR-223-3p转染浓度：50 nM；转染试剂：riboFECT CP；NLRP3过表达载体构建及感染条件。 阅读提示：Methods：Cell transfection |
| Western blot | 一抗稀释比：NLRP3 1:1000，ASC 1:1000，caspase-1 1:1000，cleaved caspase-1 1:1000，GSDMD 1:1000，GSDMD-NT 1:1000，IL-1β 1:1000，IL-18 1:1000，CDK6 1:50000，CDK4 1:50000，cyclin D1 1:10000，CDK2 1:1000，cyclin E1 1:1000，caspase-3 1:5000，Bcl-2 1:2000，Bax 1:2000，β-actin 1:5000；二抗1:20000。 阅读提示：Methods：Western blot，Table 4 |
| RT-qPCR | RNA量500 ng，反应条件：95°C 30秒，40循环95°C 10秒，60°C 10秒；使用2−ΔΔCt法分析。 阅读提示：Methods：RT-qPCR |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC和PI染色，室温避光孵育15分钟，1小时内流式分析。 阅读提示：Methods：Flow cytometry analysis of cell apoptosis |
| 细胞周期检测 | 70%乙醇固定4°C 4小时，PI染色37°C避光30分钟，24小时内488 nm波长流式分析。 阅读提示：Methods：Flow cytometric analysis of cell cycle |
| ELISA | IL-1β和IL-18检测，样品为细胞培养上清，按试剂盒说明书操作。 阅读提示：Methods：ELISA detection of IL-1β and IL-18 Levels |
| MTT实验 | 细胞密度1×10^4/孔，MTT浓度0.5 mg/mL，孵育4小时，DMSO溶解后测吸光度。 阅读提示：Methods：MTT assay for determining cell IC50 |
| EDU实验 | EdU工作液终浓度1X，孵育2小时；4%多聚甲醛固定15分钟；Triton X-100透化15分钟；DAPI染色5分钟。 阅读提示：Methods：EDU assay for detecting cell proliferation |
| 双荧光素酶报告 | 靶基因质粒与参照质粒比例50:1，共转染HEK-293T细胞48小时；突变位点序列：CGCUAUCUUUCUAUUAACUGACC。 阅读提示：Methods：Dual-luciferase reporter assay |