CCDC58表达分析
评估CCDC58在HCC组织中的表达水平及其临床意义。
使用TCGA和HPA数据库分析CCDC58在HCC和正常组织中的表达；比较HCC细胞系和正常肝细胞系中的表达。
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CCDC58作为肝细胞癌免疫细胞浸润的潜在预测生物标志物的鉴定
Identification of CCDC58 as a potential predictive biomarker of immune cell infiltration in hepatocellular carcinoma.
实验完整度
中包含生物信息学分析和体外细胞实验，但缺乏体内实验和机制验证，实验完整度中等。
主要模型
HCC细胞系（HuH-7、HepG2） 正常肝细胞系（L-02） 原代T细胞 TCGA HCC样本
重点核对
CCDC58在HCC组织中的表达水平（TCGA和HPA数据库） CCDC58表达与临床病理特征的相关性（TNM分期、组织学分级、AFP水平等） CCDC58表达与免疫细胞浸润和耗竭标志物的相关性（ssGSEA和TIMER） CCDC58敲低后对T细胞细胞毒性和迁移的影响（体外共培养和transwell实验）
摘要
背景：线粒体动力学在先天性和适应性免疫系统的正常功能中起着关键作用。含卷曲螺旋结构域58（CCDC58），一个线粒体相关基因，与包括癌症和感染在内的多种疾病有关。然而，其在肝细胞癌（HCC）中免疫细胞浸润的预测价值仍未探索。方法：本研究分析了来自癌症基因组图谱和多个在线数据集的RNA-seq数据，以探讨CCDC58与HCC中临床病理特征、预后、相关信号通路和免疫细胞浸润的相关性。此外，分离原代T细胞，并进行细胞实验如细胞毒性实验和transwell实验以验证关键结论。结果：我们发现CCDC58表达水平在HCC组织中显著增加。HCC组织中CCDC58高表达与患者的TNM分期、组织学分级、AFP水平、肿瘤状态和不良临床结局显著相关。此外，CCDC58的高表达赋予免疫激活表型降低和免疫细胞浸润不良，并与HCC中免疫细胞耗竭标志物的表达密切相关。在HCC细胞系中敲低CCDC58后，我们观察到原代T细胞的细胞毒性通过降低T细胞上的PD-1表达而增加，原代T细胞的迁移能力增强。结论：我们的研究表明CCDC58可能作为HCC中免疫细胞浸润的潜在预测生物标志物，并与HCC患者的不良预后相关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CCDC58是否可作为HCC中免疫细胞浸润的预测性生物标志物？
- 核心机制
- CCDC58可能通过影响线粒体相关基因（如SSBP1和MTRES1）的表达，调节免疫细胞浸润，并与免疫细胞耗竭标志物相关。
- 主要证据
- 基于TCGA和HPA数据库分析，发现CCDC58在HCC组织中高表达，与不良预后相关；体外实验显示敲低CCDC58可增强T细胞的细胞毒性和迁移能力，并降低T细胞PD-1表达。
- 研究意义
- 提示CCDC58可作为HCC预后和免疫浸润的预测生物标志物，为HCC免疫治疗提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
临床相关性分析
探索CCDC58表达与HCC患者临床病理特征及预后的关联。
基于TCGA临床数据，分析CCDC58表达与TNM分期、AFP水平等的关系，并评估预后。
差异表达基因和通路富集分析
鉴定与CCDC58相关的差异表达基因及富集的信号通路。
使用DESeq2识别DEGs，进行GO和GSEA分析。
免疫细胞浸润分析
评估CCDC58表达与免疫细胞浸润及耗竭标志物的相关性。
使用ssGSEA计算24种免疫细胞浸润分数，并与CCDC58表达进行相关分析。
线粒体相关基因分析
探索CCDC58相互作用蛋白和线粒体相关基因与免疫浸润的关联。
使用STRING数据库进行PPI网络分析，分析SSBP1和MTRES1与免疫浸润的关系。
体外功能验证
验证CCDC58敲低对T细胞功能的影响。
在HCC细胞系中敲低CCDC58，与原代T细胞共培养，检测T细胞细胞毒性、PD-1表达和迁移能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Excell Bio | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Hyclone | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | GDSBio | -- |
| 逆转录 | Evo M-MLV RT qPCR预混液 | Accurate Biology | -- |
| qPCR | LightCycler 480 PCR仪 | Roche Diagnostics | -- |
| SYBR Green Pro Taq HS预混液 | Accurate Biology | -- | |
| siRNA转染 | 脂质体3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| 兔抗CCDC58抗体 | Bioss | bs-8080R | |
| GAPDH兔抗体 | CST | 5174 | |
| 抗兔IgG, HRP标记抗体 | CST | 7074 | |
| T细胞分离 | Lymphoprep淋巴细胞分离液 | -- | -- |
| EasySep人T细胞分选试剂盒 | Stemcell | -- | |
| T细胞培养 | T细胞激活剂 | Miltenyi Biotec | -- |
| TexMACS培养基 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 白细胞介素-2 | Miltenyi Biotec | -- | |
| CD3染色 | Biolegend | -- | |
| 细胞毒性实验 | 96孔板 | Corning | -- |
| 荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| 流式分析 | BV421抗人CD279抗体 | Biolegend | -- |
| APC抗人CD3抗体 | Biolegend | -- | |
| Transwell实验 | 5μm孔径Transwell小室 | Jet Biofil | -- |
| 精确计数微球 | BioLegend | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞培养条件：Huh-7和HepG2使用DMEM，补充10% FBS和100 U/ml青霉素/100 µg/ml链霉素；L-02使用同样条件；培养于37℃和5% CO2。 阅读提示：Methods：Cell lines and cell culture |
| CCDC58敲低 | siRNA序列及转染试剂：使用siRNA#2（序列5'-GGACGAUUUAACGUUAUUAAATT-3'）用于敲低，转染试剂为Lipofectamine 3000和RNAiMAX。 阅读提示：Methods：Small interfering RNA transfection |
| 原代T细胞分离 | 使用健康志愿者外周血，通过密度梯度离心分离PBMCs，用EasySep试剂盒阴性选择总CD3+T细胞，纯度>98%。 阅读提示：Methods：Primary T cell isolation, culture, and stimulation |
| 细胞毒性实验 | HCC细胞与T细胞共培养的E:T比例（10:1或5:1）和时间（12h和48h），以及荧光素酶活性检测。 阅读提示：Figure legends：Fig. 9C, D；Methods：Luciferase-based cytotoxic assay |
| PD-1表达检测 | T细胞与HCC细胞上清共培养55小时后，通过流式细胞术检测PD-1表达。 阅读提示：Methods：Analysis of PD-1 expression on T cell；Figure S2A-B |
| Transwell迁移实验 | 使用5 μm孔径的transwell小室，T细胞接种于上室，下室加入HCC细胞上清，培养8小时后计数迁移细胞。 阅读提示：Methods：Transwell assay；Figure 9E-F |