基于液相色谱-质谱联用和网络分析的猫爪草总皂苷治疗乳腺癌的机制研究

Mechanism of total saponins of Ranunculus ternatus Thunb. in treatment of breast cancer based on liquid chromatography-mass spectrometry and network analysis.

作者信息Yuanxin Zhang, Shuo Nan, Wei Zhao, Haisheng Xie, Jinxin Miao, Mingsan Miao
PMID40351419
发布时间2025-04-16
DOI10.3389/fphar.2025.1506885

实验完整度

高

研究包含网络药理学预测、体外细胞功能实验(MCF-7细胞增殖、迁移、凋亡)及体内动物模型验证等至少两个独立证据层级,并有机制验证。

主要模型

乳腺癌小鼠模型(4T1细胞原位移植) MCF-7人乳腺癌细胞系

重点核对

RT总皂苷浓度:体外实验使用50 μg/mL和100 μg/mL;体内实验高、中、低剂量分别为200、100、50 mg/kg/d 给药方式:体内实验采用灌胃(0.1 mL/10 g),连续14天 对照组设置:体内实验设空白组、模型组、Nolvadex阳性对照组;体外实验设空白对照组 检测指标:肿瘤体积(每3天测量)和重量,血清炎症因子(IL-6、TNF-α、IL-10),JAK2/STAT3蛋白及mRNA表达,细胞凋亡率 统计学方法:数据以均数±标准差表示,组间差异采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验,P<0.05为差异有统计学意义

摘要

目的:利用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术和网络分析探讨猫爪草(RT)总皂苷治疗乳腺癌(BC)的机制。方法:采用LC-MS检测RT的代谢物。在不同数据库中鉴定RT和BC的代谢物及靶点,并通过蛋白质-蛋白质相互作用网络和通路富集分析预测潜在靶点和通路。以细胞注射构建的乳腺癌小鼠模型和MCF-7细胞作为研究对象进行体内外验证实验,研究RT的抗乳腺癌机制。结果:京都基因与基因组百科全书分析显示,Janus激酶/信号转导与转录激活因子信号通路可能与RT的抗乳腺癌作用有关。体内外实验表明,RT总皂苷具有良好的抗乳腺癌作用,可抑制JAK2和STAT3相关蛋白及mRNA的表达,影响血清炎症因子肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和白细胞介素-10的表达水平,抑制肿瘤生长、增殖和迁移,并促进肿瘤细胞凋亡。结论:RT总皂苷可能通过调节JAK2/STAT3信号通路在乳腺癌治疗中发挥作用。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
猫爪草总皂苷(RRTS)治疗乳腺癌的潜在分子机制是什么?
核心机制
RRTS通过抑制JAK2/STAT3信号通路激活,调节上下游炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-10),抑制肿瘤生长、增殖和迁移,促进凋亡。
主要证据
体内实验中,RRTS显著降低肿瘤体积和重量,抑制Ki-67表达,降低p-JAK2、p-STAT3蛋白水平及上调凋亡相关蛋白Bax、下调Bcl-2;体外实验显示RRTS抑制MCF-7细胞增殖、迁移,促进凋亡,并降低炎症因子水平。
研究意义
为RT在乳腺癌治疗中的临床应用提供理论依据,支持其通过调节JAK2/STAT3信号通路发挥抗乳腺癌作用。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

LC-MS代谢物鉴定

鉴定RT中的主要化学成分,为后续网络药理学和机制研究提供物质基础。

采用LC-MS对RT乙醇提取物进行检测,分析其化学成分,鉴定出53种化合物,主要为萜类、酚类和特殊结构化合物。

2

网络药理学预测靶点与通路

预测RT治疗BC的潜在作用靶点和信号通路。

利用TCMSP、Swiss Target Prediction等数据库预测RT活性成分靶点,整合BC疾病靶点,构建PPI网络和进行GO/KEGG富集分析。

3

体内动物实验验证RRTS抗肿瘤作用

验证RRTS在体内对乳腺癌肿瘤生长的抑制作用及其对JAK2/STAT3通路的影响。

建立4T1细胞原位移植乳腺癌小鼠模型,分组灌胃给予不同剂量RRTS或Nolvadex,连续14天,观察肿瘤生长、血清炎症因子、组织病理、免疫组化和qRT-PCR检测。

4

体外细胞实验验证RRTS抗肿瘤作用

在细胞水平验证RRTS对乳腺癌细胞增殖、迁移、凋亡及JAK2/STAT3通路的影响。

使用MCF-7细胞进行CCK-8增殖实验、细胞划痕实验、流式细胞术凋亡检测、ELISA检测炎症因子、In-Cell Western检测蛋白表达、qRT-PCR检测mRNA表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Agilent SB-C18液相色谱柱Agilent--
刺五加苷A标准品成都普思生物科技PS0811-0025
胎牛血清AusbianS711-001S
含双抗的RPMI-1640基础培养基武汉普诺赛生命科技有限公司PM150110A
小鼠IL-6 ELISA试剂盒苏州卡尔文生物科技有限公司CK-E20012M
小鼠TNF-α ELISA试剂盒苏州卡尔文生物科技有限公司CK-E20220M
小鼠IL-10 ELISA试剂盒苏州卡尔文生物科技有限公司CK-E20206M
人IL-6 ELISA试剂盒苏州卡尔文生物科技有限公司CK-E20665M
人TNF-α ELISA试剂盒苏州卡尔文生物科技有限公司CK-E20036M
人IL-10 ELISA试剂盒苏州卡尔文生物科技有限公司CK-E20667M
兔抗Bax一抗北京博奥森bs-0127R
兔抗Bcl-2一抗北京博奥森bs-4563R
兔GAPDH抗体武汉三鹰生物技术GB-15004
兔抗p-JAK2一抗Biossbs-3206R
山羊抗兔IgG H&L抗体(IRDye800CW)Biossbs-40295G-IRDye800CW
FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒V2南京诺唯赞生物科技RC112
HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)南京诺唯赞生物科技R323
ChamQ通用型SYBR qPCR预混液南京诺唯赞生物科技Q711
CCK-8试剂盒----
Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒----
他莫昔芬----
BALB/c小鼠济南朋悦实验动物繁育有限公司--
酶标仪(BIO-RAD680)BIO-RAD--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
LC-MS代谢物分析
色谱柱型号、流动相梯度、流速、柱温、进样量、质谱参数(电离温度、喷雾电压、气体压力)
阅读提示:Methods 2.2节和Supplementary Table S2
网络药理学分析
数据库来源、筛选条件(如相互作用分数)、核心靶点定义(degree值top 20)
阅读提示:Methods 2.3-2.5节
体内动物实验
小鼠品系、周龄、性别、体重、接种细胞系及数量、分组、给药剂量和方式、给药时间、肿瘤测量方法、取材时间
阅读提示:Methods 2.6节和Figure 3图例
体外细胞实验
细胞系(MCF-7)、培养条件、药物浓度(50和100 μg/mL)、处理时间、各实验的具体步骤(如划痕实验的细胞密度、划痕时间点;凋亡检测的染色和流式分析)
阅读提示:Methods 2.7节和Figure 5图例
统计分析
数据表示方式、统计学方法(单因素方差分析、Dunnett检验)、P值显著性阈值
阅读提示:Methods 2.8节