LC-MS代谢物鉴定
鉴定RT中的主要化学成分,为后续网络药理学和机制研究提供物质基础。
采用LC-MS对RT乙醇提取物进行检测,分析其化学成分,鉴定出53种化合物,主要为萜类、酚类和特殊结构化合物。
Mechanism of total saponins of Ranunculus ternatus Thunb. in treatment of breast cancer based on liquid chromatography-mass spectrometry and network analysis.
研究包含网络药理学预测、体外细胞功能实验(MCF-7细胞增殖、迁移、凋亡)及体内动物模型验证等至少两个独立证据层级,并有机制验证。
乳腺癌小鼠模型(4T1细胞原位移植) MCF-7人乳腺癌细胞系
RT总皂苷浓度:体外实验使用50 μg/mL和100 μg/mL;体内实验高、中、低剂量分别为200、100、50 mg/kg/d 给药方式:体内实验采用灌胃(0.1 mL/10 g),连续14天 对照组设置:体内实验设空白组、模型组、Nolvadex阳性对照组;体外实验设空白对照组 检测指标:肿瘤体积(每3天测量)和重量,血清炎症因子(IL-6、TNF-α、IL-10),JAK2/STAT3蛋白及mRNA表达,细胞凋亡率 统计学方法:数据以均数±标准差表示,组间差异采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验,P<0.05为差异有统计学意义
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定RT中的主要化学成分,为后续网络药理学和机制研究提供物质基础。
采用LC-MS对RT乙醇提取物进行检测,分析其化学成分,鉴定出53种化合物,主要为萜类、酚类和特殊结构化合物。
预测RT治疗BC的潜在作用靶点和信号通路。
利用TCMSP、Swiss Target Prediction等数据库预测RT活性成分靶点,整合BC疾病靶点,构建PPI网络和进行GO/KEGG富集分析。
验证RRTS在体内对乳腺癌肿瘤生长的抑制作用及其对JAK2/STAT3通路的影响。
建立4T1细胞原位移植乳腺癌小鼠模型,分组灌胃给予不同剂量RRTS或Nolvadex,连续14天,观察肿瘤生长、血清炎症因子、组织病理、免疫组化和qRT-PCR检测。
在细胞水平验证RRTS对乳腺癌细胞增殖、迁移、凋亡及JAK2/STAT3通路的影响。
使用MCF-7细胞进行CCK-8增殖实验、细胞划痕实验、流式细胞术凋亡检测、ELISA检测炎症因子、In-Cell Western检测蛋白表达、qRT-PCR检测mRNA表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| LC-MS分析 | Agilent SB-C18液相色谱柱 | Agilent | -- |
| 刺五加苷A标准品 | 成都普思生物科技 | PS0811-0025 | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Ausbian | S711-001S |
| 含双抗的RPMI-1640基础培养基 | 武汉普诺赛生命科技有限公司 | PM150110A | |
| ELISA | 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | 苏州卡尔文生物科技有限公司 | CK-E20012M |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | 苏州卡尔文生物科技有限公司 | CK-E20220M | |
| 小鼠IL-10 ELISA试剂盒 | 苏州卡尔文生物科技有限公司 | CK-E20206M | |
| 人IL-6 ELISA试剂盒 | 苏州卡尔文生物科技有限公司 | CK-E20665M | |
| 人TNF-α ELISA试剂盒 | 苏州卡尔文生物科技有限公司 | CK-E20036M | |
| 人IL-10 ELISA试剂盒 | 苏州卡尔文生物科技有限公司 | CK-E20667M | |
| Western blot/ICW | 兔抗Bax一抗 | 北京博奥森 | bs-0127R |
| 兔抗Bcl-2一抗 | 北京博奥森 | bs-4563R | |
| 兔GAPDH抗体 | 武汉三鹰生物技术 | GB-15004 | |
| 兔抗p-JAK2一抗 | Bioss | bs-3206R | |
| 山羊抗兔IgG H&L抗体(IRDye800CW) | Bioss | bs-40295G-IRDye800CW | |
| qRT-PCR | FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒V2 | 南京诺唯赞生物科技 | RC112 |
| HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper) | 南京诺唯赞生物科技 | R323 | |
| ChamQ通用型SYBR qPCR预混液 | 南京诺唯赞生物科技 | Q711 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | -- | -- |
| 细胞处理 | 他莫昔芬 | -- | -- |
| 动物实验 | BALB/c小鼠 | 济南朋悦实验动物繁育有限公司 | -- |
| 酶标仪 | 酶标仪(BIO-RAD680) | BIO-RAD | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LC-MS代谢物分析 | 色谱柱型号、流动相梯度、流速、柱温、进样量、质谱参数(电离温度、喷雾电压、气体压力) 阅读提示:Methods 2.2节和Supplementary Table S2 |
| 网络药理学分析 | 数据库来源、筛选条件(如相互作用分数)、核心靶点定义(degree值top 20) 阅读提示:Methods 2.3-2.5节 |
| 体内动物实验 | 小鼠品系、周龄、性别、体重、接种细胞系及数量、分组、给药剂量和方式、给药时间、肿瘤测量方法、取材时间 阅读提示:Methods 2.6节和Figure 3图例 |
| 体外细胞实验 | 细胞系(MCF-7)、培养条件、药物浓度(50和100 μg/mL)、处理时间、各实验的具体步骤(如划痕实验的细胞密度、划痕时间点;凋亡检测的染色和流式分析) 阅读提示:Methods 2.7节和Figure 5图例 |
| 统计分析 | 数据表示方式、统计学方法(单因素方差分析、Dunnett检验)、P值显著性阈值 阅读提示:Methods 2.8节 |