验证HBsAg抑制IFNβ信号通路
评估HBsAg对I型干扰素产生的影响。
在THP-1细胞中通过LPS、poly(I:C)、HT-DNA刺激或SeV、HSV-1感染，检测IFNB1 mRNA水平；使用TRIF、RIG-I、cGAS等适配体激活IFNβ启动子报告基因；在IFNAR1敲除的Huh7细胞中检测病毒复制。
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乙型肝炎表面抗原劫持TANK结合激酶1以抑制I型干扰素并诱导早期自噬
Hepatitis B surface antigen hijacks TANK-binding kinase 1 to suppress type I interferon and induce early autophagy.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内转基因小鼠模型、患者肝组织样本，并进行了机制验证（如TBK1突变体、抑制剂）和功能验证（如自噬检测、病毒复制检测）。
主要模型
Huh7肝癌细胞系 HepG2肝癌细胞系 HBsAg转基因小鼠（C57BL/6J-TgN(AlblHBV)44Bri） 慢性HBV患者肝组织
重点核对
HBsAg与TBK1激酶结构域（KD）的相互作用 TBK1二聚化及TBK1-IRF3复合物破坏 TBK1-p62信号轴介导的自噬诱导 SNAP29启动子的抑制 BX795对TBK1活性的抑制浓度（1 μM）
摘要
先天免疫和自噬之间存在密切联系。然而，在感染乙型肝炎病毒（HBV）的宿主细胞中，先天免疫与自噬之间的相互作用仍不清楚。在此，我们报道HBsAg抑制I型干扰素的产生并诱导自噬体的积累。HBsAg在离体和体内均能增强TANK结合激酶1（TBK1）的磷酸化，并抑制干扰素调节因子3（IRF3）的磷酸化。机制研究表明，HBsAg与TBK1的激酶结构域（KD）相互作用增强了其二聚化，但破坏了TBK1–IRF3复合物。使用TBK1抑制剂BX795，我们发现HBsAg增强的TBK1二聚化促进sequestosome-1（p62）磷酸化，这对于HBV诱导的自噬和HBV复制是必需的。此外，HBsAg通过抑制突触体相关蛋白29（SNAP29）启动子来阻断自噬体与溶酶体的融合。值得注意的是，来自HBsAg转基因小鼠或慢性HBV患者的肝组织显示IFNβ信号传导被抑制，并诱导了不完全自噬。这些发现提出了一种新的机制，通过该机制HBsAg靶向TBK1抑制I型干扰素并诱导早期自噬，可能导致HBV持续感染。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HBV感染中HBsAg如何通过调控TBK1影响先天免疫和自噬之间的相互作用？
- 核心机制
- HBsAg通过其S域与TBK1的激酶结构域结合，增强TBK1二聚化并促进p62磷酸化，从而诱导早期自噬；同时破坏TBK1-IRF3复合物抑制I型干扰素产生；并通过抑制SNAP29启动子阻断自噬体-溶酶体融合。
- 主要证据
- 体外实验显示HBsAg与TBK1相互作用并影响TBK1/IRF3磷酸化和二聚化；细胞中HBsAg诱导自噬体积累，抑制SNAP29表达；HBs-Tg小鼠和CHB患者肝组织中也观察到相似变化；TBK1抑制剂和敲除实验证实TBK1在HBV复制中的作用。
- 研究意义
- 本研究揭示了HBsAg通过靶向TBK1来抑制I型干扰素和诱导早期自噬的机制，为HBV持续感染提供了新的见解，可能有助于消除持续性HBV感染。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定HBsAg与TBK1的相互作用
确定HBsAg是否与TBK1结合及其结合结构域。
通过免疫共沉淀（IP）检测HBsAg与TBK1及其截短突变体的相互作用；共定位分析；在HBV感染的HepG2-hNTCP细胞中验证内源性相互作用。
验证HBsAg增强TBK1二聚化并抑制IRF3激活
探究HBsAg对TBK1和IRF3活化的影响。
转染HBs后检测TBK1和IRF3磷酸化水平；通过native PAGE检测TBK1和IRF3二聚化；通过核质分离检测IRF3核转位；使用TBK1突变体（EE、HIF等）验证二聚化依赖性。
验证HBsAg通过TBK1-p62轴诱导早期自噬
检查HBsAg诱导的自噬是否依赖TBK1及p62。
在Huh7细胞中检测LC3转化和p62磷酸化；使用BX795抑制TBK1观察自噬的变化；在TBK1敲除细胞中回补TBK1或突变体，检测LC3转化和自噬体形成。
验证HBsAg抑制SNAP29启动子阻断自噬体-溶酶体融合
探索HBsAg阻碍自噬降解的分子机制。
检测自噬相关基因mRNA水平；构建SNAP29启动子荧光素酶报告基因检测启动子活性；通过mCherry-GFP-LC3质粒检测自噬流；检测LAMP1与LC3共定位。
验证HBV复制依赖TBK1活性及自噬
研究TBK1活性对HBV复制的影响。
在Huh7细胞中抑制TBK1（BX795）或敲除TBK1，检测HBV DNA、HBsAg、HBeAg水平；使用3-MA或shATG7阻断自噬，观察对BX795作用的影响。
体内验证HBsAg对先天免疫和自噬的影响
在动物模型中验证HBsAg对干扰素信号和自噬的影响。
HBs-Tg小鼠与WT小鼠注射poly(I:C)后检测肝组织IRF3核转位、干扰素和ISG表达；检测LC3、TBK1、p62、SNAP29表达及自噬体。
慢性HBV患者肝组织验证
验证慢性HBV感染中先天免疫和自噬的变化。
收集慢性HBV和非HBV患者肝组织，进行免疫组化和免疫荧光染色检测p-TBK1、p-IRF3、p-p62、p62、SNAP29及LC3和LAMP1。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 阿霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | 脂质体转染试剂2000 | Invitrogen | 11668030 |
| 聚乙烯亚胺 | Sigma | 9002-98-6 | |
| 刺激与处理 | 脂多糖 | Sigma Aldrich | L2880 |
| Earle's平衡盐溶液 | Sigma Aldrich | E7510 | |
| 聚肌胞苷酸 | Sigma Aldrich | 31852-29-6 | |
| 胸腺DNA | Solarbio | D8050 | |
| 巴弗洛霉素A1 | Solarbio | A8510 | |
| BX795 | APExbio | A8222 | |
| 雷帕霉素 | APExbio | A8167 | |
| 氯喹 | APExbio | A8628 | |
| 3-甲基腺嘌呤 | APExbio | A8353 | |
| 病毒制备与感染 | 聚乙二醇8000 | Sigma-Aldrich | 89610 |
| 蛋白提取与检测 | 蛋白酶抑制剂混合物 | MedChemExpress | HY-K0012 |
| 蛋白A/G琼脂糖 | Pierce | 20421 | |
| 非变性凝胶上样缓冲液 | Servicebio | G2034-1ML | |
| 非变性凝胶 | Servicebio | G2042-50T | |
| RNA提取与检测 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| TRUEscript H Minus M-MuLV逆转录酶 | Aidlab Biotechnologies | PC1703 | |
| 通用SYBR Green快速qPCR预混液 | ABclonal | RK21203 | |
| 荧光素酶检测 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E2920 |
| 电镜 | Polybed 812树脂 | Polysciences | 025950-1 |
| 透射电子显微镜（JEM-1400plus） | JEOL | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8 | GraphPad | -- |
| 抗体 | 抗Flag抗体 | Medical & Biological Laboratories | M185-3L |
| 抗HA抗体 | Medical & Biological Laboratories | M180-3 | |
| 抗Myc抗体 | Medical & Biological Laboratories | M192-3 | |
| 抗TBK1抗体 | ABclonal | A3458 | |
| 抗磷酸化TBK1抗体 | ABclonal | AP1418 | |
| 抗IRF3抗体 | ABclonal | A19717 | |
| 抗磷酸化IRF3抗体 | ABclonal | AP1412 | |
| 抗p62抗体 | ABclonal | A19700 | |
| 抗LC3B抗体 | ABclonal | A19665 | |
| 抗BiP抗体 | ABclonal | A4908 | |
| 抗ATF4抗体 | ABclonal | A0201 | |
| 抗ATG7抗体 | ABclonal | A19604 | |
| 抗SNAP29抗体 | ABclonal | A4290 | |
| 抗LAMP1抗体 | ABclonal | A21194 | |
| 抗GAPDH抗体 | ProteinTech | 60004-1-Ig | |
| 抗GFP抗体 | ProteinTech | 66002-1-Ig | |
| 抗Lamin A/C抗体 | ProteinTech | 10298-1-AP | |
| 抗磷酸化p62抗体 | ImmunoWay | YP1505 | |
| 抗HBsAg抗体 | Bioss | bs-1557G | |
| 抗山羊IgG-Cy3 | Absin | abs20028 | |
| 抗小鼠IgG-CY3 | Absin | abs20142 | |
| 抗小鼠IgG-FITC | Absin | abs20012 | |
| 抗兔IgG-FITC | Absin | abs20023 | |
| 抗小鼠IgG-HRP | Biodragon | BF03001 | |
| 抗兔IgG-HRP | Biodragon | BF03008 | |
| 抗山羊IgG-HRP | Biodragon | BF03015 | |
| 病毒株 | 仙台病毒株 | -- | -- |
| 甲型流感病毒PR/8/34 (H1N1) | -- | -- | |
| 重组水疱性口炎病毒（VSV-GFP） | -- | -- | |
| 重组单纯疱疹病毒（HSV-GFP） | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系：Huh7、HepG2、HepG2-hNTCP、HepAD38；培养基：DMEM/F-12、PMM；血清浓度：10% FBS；抗生素：100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素；培养条件：5% CO2、37°C 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and transfection |
| 刺激与感染 | LPS浓度：4 μg/ml；poly (I:C)浓度：10 μg/ml；HT-DNA浓度：10 μg/ml；SeV感染MOI：1；HSV-GFP/VSV-GFP感染 阅读提示：Materials and methods: Plasmids, antibodies, and reagents; Results: HBsAg negatively regulates IFNβ through TBK1 |
| 抑制剂处理 | BX795浓度：1 μM；BafA1浓度：100 nM；CQ浓度：10 μM；RAPA浓度：2.5 μM；3-MA浓度：2.5 mM 阅读提示：Materials and methods: Plasmids, antibodies, and reagents; Results: HBsAg-induced autophagy |
| 转染条件 | 转染试剂：Lipofectamine 2000、PEI；转染时间：例如24h、36h、48h 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and transfection |
| 动物实验 | 小鼠品系：C57BL/6J-TgN (AlblHBV) 44Bri（HBs-Tg）和WT C57BL/6；年龄：9周龄；注射剂量：poly (I:C) 5 mg/kg；注射途径：尾静脉；注射体积：1 ml/kg PBS；观察时间：24h 阅读提示：Materials and methods: Mice; Results: HBsAg modulates innate immunity and autophagic flux in HBs-Tg mice |
| HBV制备与感染 | HepAD38细胞培养天数：3天；HBV浓缩：100倍；感染剂量：1000基因组当量；感染时间：约16小时 阅读提示：Materials and methods: Preparation of HBV from HepAD38 cells and infection with HepG2-hNTCP cells |
| 检测方法 | qRT-PCR引物序列：表S3；RNA提取：TRIzol；免疫印迹：抗体稀释浓度未明确；荧光显微镜：LC3阳性斑点计数30个细胞 阅读提示：Materials and methods: RNA quantification; Confocal microscopy; Evaluation of autophagy flux |