收集临床样本和基本资料
比较肺结核患者与健康对照的临床特征,确认研究对象的代表性。
纳入43例活动性肺结核患者和37例健康对照,收集外周血和病变组织,记录年龄、性别、白蛋白、C反应蛋白、白细胞等指标。
Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2 Mediates the Involvement of M2-Type Macrophages in Pulmonary Tuberculosis Infection.
包含患者样本的ELISA、qRT-PCR、HE和IHC检测,但缺乏功能验证和机制实验。
肺结核患者外周血 肺结核病变组织
痰涂片或培养阳性或胸片显示活动性肺结核的43例患者 ELISA检测IL-10和IL-12的血清浓度 qRT-PCR检测TREM2、IL-10、IL-12的mRNA相对表达量 IHC检测TREM2、CD68、iNOS、CD163的表达及定位 Spearman相关性分析TREM2与IL-10、IL-12的相关性
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较肺结核患者与健康对照的临床特征,确认研究对象的代表性。
纳入43例活动性肺结核患者和37例健康对照,收集外周血和病变组织,记录年龄、性别、白蛋白、C反应蛋白、白细胞等指标。
观察肺结核病变的病理特征并确认结核感染。
采用HE染色观察病理表现,IHC检测Ag85B的表达。
明确TREM2和M1/M2巨噬细胞标志物在病变组织中的定位及表达差异。
采用IHC检测结核病变和远端组织中TREM2、CD68、iNOS、CD163的表达和定位。
比较肺结核患者和健康对照外周血中M1/M2相关细胞因子IL-10和IL-12的表达水平。
使用ELISA检测血清中IL-10和IL-12的浓度。
比较肺结核患者和健康对照外周血中TREM2、IL-10、IL-12的mRNA相对表达水平。
提取外周血RNA,通过qRT-PCR检测TREM2、IL-10、IL-12的mRNA相对表达量,并采用2−ΔΔCt法计算。
评估TREM2与M2型巨噬细胞相关的细胞因子IL-10和M1型相关的IL-12之间的相关性。
使用Spearman相关分析评估TREM2与IL-10、IL-12的mRNA表达的相关性。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学染色 | Ag85B抗体 | Bioss | bs-6460R |
| TREM2抗体 | Bioss | bs-2723R | |
| CD68抗体 | Abcam | ab955 | |
| iNOS抗体 | Bioss | bs-0162R | |
| CD163抗体 | Bioss | bs-2527R | |
| ELISA | IL-10 ELISA试剂盒 | Shanghai Jiang Lai Biotechnology Co., Ltd. | JL19246 |
| IL-12 ELISA试剂盒 | Shanghai Jiang Lai Biotechnology Co., Ltd. | JL18332 | |
| qRT-PCR(RNA提取) | TransZol Up Plus RNA试剂盒 | -- | -- |
| qRT-PCR(cDNA合成) | cDNA合成试剂盒 | Takara | RR037 |
| qRT-PCR(PCR反应) | PCR试剂盒 | Takara | RR820 |
| 图像分析 | Image-Pro Plus | -- | 8.0.1 |
| 统计分析 | GraphPad Prism | -- | 8.0.1 |
| SPSS | -- | 26.0 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 纳入标准:肺结核诊断符合WS288-2017;排除其他免疫疾病、肿瘤、肺部感染和HIV感染。 阅读提示:Methods, Research Objects |
| HE染色 | 染色时间:苏木精1分钟,伊红3分钟,1%盐酸乙醇1秒,PBS返蓝。 阅读提示:Methods, HE Staining |
| IHC染色 | 抗体浓度:TREM2 1:200,CD68 1:2000,iNOS 1:300,CD163 1:100;抗原修复时间15分钟;一抗孵育4°C 14小时;二抗37°C 90分钟;DAB显色2.5分钟±10秒。 阅读提示:Methods, IHC Staining; Table 1 |
| ELISA | 试剂盒品牌及货号:IL-10(JL19246),IL-12(JL18332);按说明书操作,标准曲线采用四参数logistic函数。 阅读提示:Methods, Elisa |
| qRT-PCR | RNA浓度>80ng/μL,纯度OD260/OD280=1.8–2.0;cDNA合成试剂盒Takara RR037;PCR试剂盒Takara RR820;反应条件:预变性95°C 30s,40个循环95°C 5s和60°C 34s。 阅读提示:Methods, qRT-PCR |
| 统计分析 | 正态分布数据用t检验,非正态用Wilcoxon检验,计数资料用卡方检验,相关性用Pearson或Spearman相关分析;P<0.05为显著。 阅读提示:Methods, Statistical Analysis |