筛选与鉴定VP2互作宿主蛋白
鉴定MVC感染细胞中与VP2相互作用的宿主蛋白，以揭示病毒入侵机制。
用抗VP2抗体对MVC感染WRD细胞裂解液进行免疫沉淀（IP），SDS-PAGE分离后质谱分析，鉴定候选蛋白，并通过Co-IP验证VP2与ROCK1的相互作用。
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犬细小病毒（MVC）激活RhoA/ROCK1/MLC2信号转导通路导致紧密连接解离并促进Occludin介导的病毒感染
The Minute Virus of Canines (MVC) Activates the RhoA/ROCK1/MLC2 Signal Transduction Pathway Resulting in the Dissociation of Tight Junctions and Facilitating Occludin-Mediated Viral Infection.
实验完整度
高研究包含体外细胞模型（WRD、COS-1）的感染实验、蛋白相互作用验证（Co-IP、GST-pulldown、共定位）、通路激活验证（抑制剂、siRNA）、病毒滴度及膜通透性检测等多层级证据。
主要模型
WRD细胞 COS-1细胞
重点核对
MVC感染WRD细胞的MOI=1 RhoA抑制剂CCG-1423浓度4 μM ROCK1抑制剂Y27632浓度20 μM siROCK1转染浓度100 nM qRT-PCR检测病毒基因组拷贝数的时间点：6 h, 12 h, 18 h
摘要
犬细小病毒（MVC）属于细小病毒科博卡病毒属，与新生犬的肠炎和胚胎感染有关。病毒附着于宿主细胞是感染的关键步骤，病毒蛋白2（VP2）作为MVC的重要结构蛋白，影响宿主选择和感染严重程度。然而，关于VP2蛋白与宿主细胞之间的相互作用知之甚少。在本研究中，我们通过质谱和免疫沉淀方法鉴定出VP2直接与RhoA相关蛋白激酶1（ROCK1）的激酶域相互作用，并证明在Walter Reed犬细胞/3873D（WRD）细胞中，MVC感染早期激活了RhoA/ROCK1/肌球蛋白轻链2（MLC2）信号通路。进一步研究表明，RhoA/ROCK1介导的MLC2磷酸化触发肌动蛋白环收缩，破坏紧密连接，并暴露紧密连接蛋白Occludin，从而促进VP2与Occludin的相互作用。RhoA和ROCK1的特异性抑制剂恢复了MVC诱导的Occludin细胞内转位和细胞膜通透性增加。此外，这两种抑制剂显著降低了病毒蛋白表达和基因组拷贝数。总之，我们的研究首次提供了MVC结构蛋白VP2与ROCK1直接相互作用的证据，并表明紧密连接蛋白Occludin可作为MVC感染的潜在共受体，这可能为抗MVC策略提供新靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MVC感染过程中，VP2蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用及其在病毒侵入中的作用机制尚不清楚。
- 核心机制
- MVC的VP2蛋白直接与ROCK1激酶域结合，激活RhoA/ROCK1/MLC2信号通路，导致MLC2磷酸化，引发肌动蛋白环收缩，破坏紧密连接，暴露Occludin，从而促进VP2与Occludin结合，增加细胞膜通透性，最终利于病毒入侵。
- 主要证据
- 通过免疫共沉淀和质谱鉴定VP2与ROCK1互作；在WRD和COS-1细胞中验证VP2与ROCK1激酶域的直接互作及共定位；抑制剂（CCG-1423和Y27632）和siRNA敲低ROCK1均抑制MLC2磷酸化、降低Occludin表达、减少病毒基因组拷贝数和蛋白表达，并抑制Occludin内化和膜通透性增加。
- 研究意义
- 本研究首次揭示MVC VP2与ROCK1直接互作，并表明Occludin可能作为MVC感染的共受体，为抗MVC策略提供了新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证VP2与ROCK1激酶域的相互作用
确定VP2与ROCK1相互作用的具体结构域。
构建表达ROCK1各结构域（KD、RBD、PH-CRD）的HA标签质粒，与Flag-VP2共转染COS-1细胞，进行Co-IP；并表达纯化GST-KD融合蛋白进行GST-pulldown验证。
观察ROCK1与VP2的共定位
在细胞水平观察ROCK1与VP2的共定位及动态变化。
对MVC感染WRD细胞或共转染COS-1细胞进行免疫荧光染色，用共聚焦显微镜观察蛋白定位。
验证MVC激活RhoA/ROCK1/MLC2通路
检测MVC感染早期是否激活RhoA/ROCK1/MLC2信号通路。
感染MVC的WRD细胞在不同时间点收获，Western blot检测RhoA、ROCK1、pMLC2/MLC2表达；使用RhoA抑制剂CCG-1423和ROCK1抑制剂Y27632预处理，以及siRNA敲低ROCK1，检测MLC2磷酸化水平。
鉴定VP2与Occludin的相互作用
检测VP2是否与紧密连接蛋白Occludin、Claudin、ZO-1相互作用。
在MVC感染WRD细胞中进行Co-IP，用抗VP2或抗Occludin抗体沉淀，Western blot检测；在COS-1细胞中共转染HA-Occludin和Flag-VP2进行反向Co-IP验证。
检测RhoA/ROCK1通路对Occludin表达的影响
探究RhoA/ROCK1信号通路是否调节Occludin表达水平。
用抑制剂或siRNA处理WRD细胞后感染MVC，Western blot检测Occludin表达。
评估RhoA/ROCK1通路对病毒复制的影响
验证抑制RhoA/ROCK1信号通路是否影响MVC病毒基因组复制和蛋白表达。
预处理WRD细胞后感染MVC，在不同时间点收集细胞和上清，通过qRT-PCR检测病毒基因组拷贝数，Western blot检测VP2和NS1蛋白表达。
检测细胞膜通透性和Occludin分布
验证RhoA/ROCK1通路激活是否导致紧密连接破坏和Occludin内化，以及膜通透性增加。
抑制剂预处理后感染MVC，通过免疫荧光观察Occludin分布，并用Fluo-3 AM染色通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测胞内钙离子水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | TransGen | FI101-01 |
| 胎牛血清 | TransGen | FS201-02 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 89900 |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Proteintech | PR40025 |
| 蛋白表达纯化 | 异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷 | Solarbio | I8070 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | KeyGEN | KGP903 |
| 蛋白染色 | 考马斯亮蓝 | SEVEN Biotech | SW186 |
| GST-pulldown | GST琼脂糖珠 | TransGen | DP201 |
| SDS-PAGE | 5×上样缓冲液 | CoWin Biotech | CW 0027S |
| 药物处理 | CCG-1423 | APExBIO | B4897 |
| Y27632 | APExBIO | A3008 | |
| 二甲基亚砜 | Solarbio | D8370 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | TransGen | FC101 |
| siRNA转染 | Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985070 |
| 转染试剂 | TransGen | FT201-01 | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | 0000229835 |
| 增强化学发光底物 | SEVEN Biotech | SW181-01 | |
| Azure 300成像系统 | Azure | -- | |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 共聚焦培养皿 | BIOFIL | BDD011035 |
| 正常山羊血清 | Solarbio | SL038 | |
| Alexa Fluor 488 | Bioss | bs 0295G | |
| Alexa Fluor 647 | Bioss | bs-0296G | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| LSM 800共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| ZEN软件 | Carl Zeiss | -- | |
| qRT-PCR | RNeasy迷你试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 12183020 |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | RR047Q | |
| SGExcel FastSYBR预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| NanoDrop ND-P1000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| qTOWER3G荧光定量PCR仪 | Analytik Jena | -- | |
| 流式细胞术 | Fluo-3 AM钙离子荧光探针 | Beyotime | S1056 |
| FlowJo v10软件 | -- | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 5软件 | GraphPad | -- |
| Adobe Photoshop CC v2014软件 | Adobe | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | WRD细胞和COS-1细胞的培养条件：DMEM、10% FBS、1%青霉素-链霉素，37°C、5% CO2 阅读提示：Methods 2.1 |
| 病毒感染 | MVC感染WRD细胞的MOI=1，感染时间 阅读提示：Methods 2.1, figure legends |
| 蛋白互作验证 | Co-IP中使用的抗体（抗VP2、抗ROCK1等）及IgG对照 阅读提示：Methods 2.10, figure legends |
| 抑制剂处理 | RhoA抑制剂CCG-1423浓度4 μM，ROCK1抑制剂Y27632浓度20 μM，预处理1 h 阅读提示：Methods 2.6, Results 3.4 |
| siRNA敲低 | siROCK1转染浓度100 nM，转染时间24 h 阅读提示：Methods 2.7 |
| qRT-PCR检测 | 引物序列，扩增条件：95°C 3 min，40循环95°C 3s，60°C 20s，72°C 20s；标准曲线构建 阅读提示：Methods 2.12 |