转录组筛选差异表达基因
鉴定与SIC发病相关的潜在泛素化分子。
对LPS处理24小时的H9c2细胞进行RNA-seq，与未处理细胞比较，筛选差异表达基因并进行GO和KEGG富集分析。
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E3泛素连接酶FBXO32通过调控ANXA1/PI3K/AKT信号促进LPS诱导的心脏损伤
E3 Ubiquitin Ligase FBXO32 Promotes LPS-Induced Cardiac Injury by Regulating ANXA1/PI3K/AKT Signaling.
实验完整度
高包含体外H9c2细胞和体内大鼠模型两个独立证据层级，并进行了功能验证（凋亡、线粒体功能）和机制验证（CoIP、泛素化、挽救实验）。
主要模型
H9c2细胞LPS诱导损伤模型 SD大鼠LPS诱导心脏损伤模型
重点核对
LPS诱导浓度：10 μg/mL处理H9c2细胞24小时 LPS诱导剂量：10 mg/kg腹腔注射于大鼠 Fbxo32敲低方式：H9c2细胞使用慢病毒shRNA，大鼠使用心肌原位注射AAV9-shRNA Anxa1敲低方式：siRNA转染 关键读数：细胞活力、凋亡率、ROS水平、线粒体膜电位、心脏血流动力学和血清标志物
摘要
脓毒症诱导的心肌病（SIC）是脓毒症的严重并发症。因此，了解SIC的发病机制并开发新的治疗靶点具有重要意义。本研究探讨了F-box-only蛋白32（FBXO32）在SIC发病机制中的作用。使用脂多糖在大鼠和H9c2细胞中建立了LPS诱导的心脏损伤模型。通过电子显微镜、活性氧检测和JC-1染色确定了FBXO32对心肌细胞凋亡以及线粒体结构和功能的影响。使用蛋白质印迹法和免疫共沉淀阐明了分子机制。结果显示，在体内和体外LPS诱导的心脏损伤模型中，FBXO32表达均升高。Fbxo32敲低减轻了细胞凋亡以及线粒体和心脏功能障碍。机制分析显示，FBXO32促进膜联蛋白A1（ANXA1）的泛素化和降解，从而抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和蛋白激酶B（AKT）通路。挽救实验表明，Anxa1敲低逆转了Fbxo32敲低的效果。本研究提示，FBXO32通过介导ANXA1泛素化并抑制PI3K/AKT信号通路，加剧了LPS诱导的心脏损伤进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FBXO32在脓毒症诱导的心肌病（SIC）中是否发挥作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- FBXO32与ANXA1结合并促进其泛素化降解，从而抑制PI3K/AKT信号通路，促进心肌细胞凋亡和心脏损伤。
- 主要证据
- 在LPS诱导的H9c2细胞和大鼠模型中，FBXO32表达升高；敲低FBXO32减轻凋亡和线粒体功能障碍；CoIP和泛素化实验证实FBXO32调控ANXA1降解；挽救实验表明Anxa1敲低逆转FBXO32敲低的效果。
- 研究意义
- FBXO32是LPS诱导心脏损伤细胞凋亡的重要调节因子，是SIC潜在的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证FBXO32在体外和体内模型中的表达
确认FBXO32在LPS诱导的心脏损伤模型中表达上调。
使用qRT-PCR和western blot检测LPS处理的H9c2细胞和大鼠心肌组织中FBXO32的mRNA和蛋白表达。
体外敲低Fbxo32并评估功能
探究FBXO32对LPS诱导的H9c2细胞凋亡和线粒体功能障碍的影响。
使用慢病毒shRNA稳定敲低Fbxo32，通过CCK-8、Annexin V-FITC/PI流式、western blot、DCFH-DA和JC-1染色评估细胞活力、凋亡、凋亡相关蛋白、ROS和线粒体膜电位。
体内敲低Fbxo32并评估效果
验证FBXO32在动物模型中对心脏损伤和功能障碍的影响。
通过心肌原位注射AAV9-shRNA敲低大鼠心肌Fbxo32，采用TUNEL、western blot、TEM、血流动力学测量、血清标志物检测和HE染色评估心肌凋亡、线粒体形态、心脏功能和损伤。
检测PI3K/AKT信号通路的激活
研究FBXO32对PI3K/AKT信号通路的影响。
用western blot检测H9c2细胞和大鼠心肌组织中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT的水平。
鉴定FBXO32相互作用蛋白并验证ANXA1泛素化降解
确定FBXO32的下游底物及其调控方式。
通过CoIP-MS筛选FBXO32相互作用蛋白，验证ANXA1；用qRT-PCR和western blot检测ANXA1表达；用MG132、NH4Cl和CHX处理分析降解途径；用CoIP检测FBXO32与ANXA1的结合及泛素化水平。
挽救实验验证ANXA1介导FBXO32的功能
确认FBXO32通过ANXA1发挥其促凋亡作用。
在Fbxo32敲低的H9c2细胞中敲低Anxa1，检测细胞活力、凋亡率、凋亡蛋白、ROS、线粒体膜电位和PI3K/AKT通路蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 双特异性抗体 | Solarbio | P1400 | |
| 胰蛋白酶溶液 | Beyotime | C0207 | |
| 药物处理 | 脂多糖 | Sigma | L2360 |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TruSeq链式mRNA LT样本制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Illumina HiSeq XTen平台 | Illumina | -- | |
| 细胞转染 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| GP-transfect-Mate试剂 | GenePharma | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Biosharp | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒 | MULTI SCIENCES | -- |
| ROS检测 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | S0033S |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1试剂盒 | Beyotime | C2006 |
| 免疫沉淀 | 免疫沉淀试剂盒 | Beyotime | P2179S |
| Western blot | FBXO32抗体 | Gene Tex | GTX47819 |
| ANXA1抗体 | Proteintech | 21990-1-AP | |
| 泛素化检测 | MG132 | Selleck | S2619 |
| N-乙基马来酰亚胺 | Selleck | S3692 | |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz | sc-8017 | |
| 动物实验 | 腺相关病毒9型 | Genechem | -- |
| 呼吸机（HX-100E） | TECHMAN | -- | |
| 组织学 | TUNEL凋亡检测试剂盒 | Beyotime | C1091 |
| 电镜 | 透射电子显微镜（JEM-1400FLASH） | JEOL | -- |
| 血流动力学 | 集成信号采集和处理系统（BL-420I） | TECHMAN | -- |
| 压力传感器（PT-102N） | TECHMAN | -- | |
| ELISA | IL-6 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | ERC003.48 |
| TNF-α ELISA试剂盒 | NeoBioscience | ERC102a.48 | |
| CK-MB ELISA试剂盒 | Jiangsu Meibiao Biotechnology | MB-6930B | |
| cTnT ELISA试剂盒 | Jiangsu Meibiao Biotechnology | MB-7278B | |
| NT-proBNP ELISA试剂盒 | Jiangsu Meibiao Biotechnology | MB-1870B | |
| 酶标仪（Multiskan Spectrum 1500） | Thermo Scientific | -- | |
| qRT-PCR | 逆转录试剂盒 | Vazyme | R223 |
| ChamQ通用SYBR qRT-PCR预混液 | Vazyme | Q711 | |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | Western blot和IP细胞裂解液 | Beyotime | P0013 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012S | |
| SDS-PAGE凝胶 | Solarbio | P1200 | |
| Bcl-2抗体 | Abcam | Ab32124 | |
| Bax抗体 | Abcam | Ab32503 | |
| Cleaved Caspase-3抗体 | Affinity | AF7022 | |
| Caspase-3抗体 | Abcam | Ab32351 | |
| AKT抗体 | Immunoway | YT0177 | |
| p-AKT抗体 | Abcam | Ab81283 | |
| PI3K抗体 | Abcam | Ab151549 | |
| p-PI3K抗体 | BIOSS | bs-6417R | |
| GAPDH抗体 | Immunoway | YN5585 | |
| HRP标记的二抗 | Immunoway | RS0002 | |
| 超敏化学发光底物 | Biosharp | BL520B | |
| 化学发光成像系统（MiniChemi 610） | SINSAGE | -- | |
| ImageJ 1.52a | -- | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9.0 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与LPS处理 | H9c2细胞使用DMEM培养基+10%胎牛血清+1%双特异性抗体；LPS浓度为10 μg/mL，处理24小时。 阅读提示：Methods/细胞培养和分组 |
| 体外敲低 | 慢病毒shRNA序列（5’-GCAAAGTCACAGCTCACATCC-3’），嘌呤霉素筛选浓度2 μg/mL，筛选三代。 阅读提示：Methods/细胞转染 |
| 体内模型 | SD大鼠（7-8周龄，180-210 g），AAV9心肌原位注射25 μL（滴度1.92E+13 vg/mL），4周后腹腔注射LPS 10 mg/kg。 阅读提示：Methods/实验动物和分组，心肌注射腺相关病毒 |
| 线粒体功能检测 | ROS检测使用DCFH-DA 10 μmol/L，37°C孵育20分钟；JC-1染色使用工作液37°C孵育20分钟。 阅读提示：Methods/细胞内ROS检测，线粒体膜电位检测 |
| 泛素化分析 | MG132浓度20 μM处理6小时；N-ethylmaleimide终浓度10 μM。 阅读提示：Methods/泛素化水平分析，图6图例 |
| 挽救实验 | Anxa1 siRNA序列（5’-GCAGGAAUAUGUUCAAGCUTT-3’），使用GP-transfect-Mate试剂转染，培养48小时。 阅读提示：Methods/细胞转染，图7图例 |