hESC培养与胚状体形成
获得可用于神经诱导的hESC集落。
将hESC接种于MEF饲养层上，机械传代后培养至适当大小。
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人类胚胎干细胞来源神经元在衰老建模和基因操作中的应用方案
Protocols for the application of human embryonic stem cell-derived neurons for aging modeling and gene manipulation.
实验完整度
高包含体外细胞分化、长期培养衰老模型、siRNA基因沉默及药物处理等多层实验验证，有明确的免疫荧光和定量分析。
主要模型
H9 hESC来源神经元 H1 hESC来源神经元 hiPSC来源神经元
重点核对
hNSCs在P3代表达SOX2、PAX6、NESTIN 分化14天MAP2和TUJ1双阳性细胞比例超过90% 分化21天表达突触蛋白Synapsin-1 siRNA转染后48小时qRT-PCR和72小时免疫荧光验证敲低效率 长期培养中Lamin B1/B2下调及SA-β-Gal、Aβ、aggresome上调
摘要
体外神经元衰老模型和人类神经元（hNeurons）中的基因操作是研究脑衰老和疾病的有力工具。在此，我们提出了一种将人胚胎干细胞（hESC）来源的神经元应用于衰老建模以及进一步应用小干扰RNA（siRNA）介导的基因沉默进行功能研究的方案。我们描述了神经元分化和培养、siRNA转染的步骤，以及确保可重复性的技术注意事项。我们的方案能够研究神经元衰老的分子机制，并有助于药物评估。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用hESC来源神经元建立体外衰老模型并进行基因操作以研究神经元衰老的分子机制？
- 核心机制
- 长期培养的神经元中Lamin B1和B2表达降低，随后H3K9me3水平下降、内源性逆转录病毒重新激活、cGAS通路激活及下游干扰素信号上调。
- 主要证据
- 通过免疫荧光检测衰老标志物（Lamin B1/B2、SA-β-Gal、Aβ、aggresome）随时间变化；siRNA敲低LMNB1/LMNB2或cGAS后观察衰老表型变化；药物处理评估效果。
- 研究意义
- 该方案有助于研究神经元衰老的分子机制，并促进药物评估。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
神经诱导与hNSC生成
将hESC诱导为神经干细胞。
使用NID2培养基处理2天，再使用NID1培养基处理5天，形成胚状体；随后用Accutase消化并传代扩增hNSC。
神经元分化
获得高纯度、成熟的人类神经元。
将P5 hNSC以1.5×10^4 cells/cm²接种于Matrigel包被的培养皿，用NDM培养基诱导分化，每2-3天换液，第2-3天加Laminin处理12-18小时。
长期培养与衰老建模
建立体外神经元衰老模型。
将成熟神经元（D0）继续培养至D7（年轻）、D21（中年）、D35（ aged ），并通过免疫荧光检测衰老标志物变化。
siRNA介导的基因沉默
在长期培养的神经元中敲低特定基因以研究其功能。
使用Lipofectamine 3000将siRNA转染至神经元，转染后48小时进行qRT-PCR、72小时进行免疫荧光验证敲低效率；在D0和D6连续转染两次，于D21进行表型分析。
药物处理评估
评估小分子药物对神经元衰老的影响。
对长期培养的神经元或siRNA敲低后的神经元给予药物处理，并在换液时重新添加，直至检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | 354230 |
| DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| KnockOut血清替代物 | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| 非必需氨基酸 | GIBCO | 11140076 | |
| GlutaMAX添加剂 | GIBCO | 35050079 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-163 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Joint Protein Central | BBI-EXP-002 | |
| 高级DMEM/F12培养基 | Gibco | 12634-028 | |
| Neurobasal培养基 | Gibco | 12348-017 | |
| N2添加剂 | Gibco | 17502-048 | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504-044 | |
| 人白血病抑制因子 | Millipore | LIF1050 | |
| SB431542 | Selleck | s1067 | |
| CHIR99021 | Tocris | 252917-06-9 | |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich | P5499 | |
| Compound E | Millipore | 565790 | |
| 二丁酰环磷腺苷 | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 脑源性神经营养因子 | PeproTech | 450-02 | |
| 胶质细胞源性神经营养因子 | PeproTech | 450-10 | |
| Accutase细胞解离试剂 | Gibco | A1110501 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Y-27632 | -- | -- | |
| 基因敲低 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985070 | |
| 阴性对照siRNA | RiboBio Co., Ltd, China | -- | |
| LMNB1 siRNA | RiboBio Co., Ltd, China | -- | |
| LMNB2 siRNA | RiboBio Co., Ltd, China | -- | |
| cGAS siRNA | RiboBio Co., Ltd, China | -- | |
| 免疫荧光染色 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 |
| 正常驴血清 | Bioss | C-0008 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| VECTASHIELD防淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 衰老检测 | Proteostat蛋白聚集检测试剂盒 | Enzo | ENZ-51035-K100 |
| 抗体 | 山羊抗SOX2多克隆抗体 | Abcam | ab239218 |
| 兔抗PAX6多克隆抗体 | Covance | PRB-278P | |
| Alexa Fluo 555小鼠抗NESTIN单克隆抗体 | BD Biosciences | 560422 | |
| 兔抗Ki67多克隆抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 兔抗TUJ1多克隆抗体 | Sigma-Aldrich | T2200 | |
| 小鼠抗MAP2单克隆抗体 | Sigma-Aldrich | M4403 | |
| 鸡抗MAP2多克隆抗体 | Abcam | ab5392 | |
| 兔抗Lamin B1多克隆抗体 | Abcam | ab16048 | |
| 兔抗Lamin B2单克隆抗体 | Abcam | ab151735 | |
| 小鼠抗β淀粉样蛋白(4G8)单克隆抗体 | BioLegend | 800701 | |
| Alexa Fluo 568驴抗小鼠IgG (H+L) | Invitrogen | A-10037 | |
| Alexa Fluo 568驴抗兔IgG (H+L) | Invitrogen | A-10042 | |
| Alexa Fluo 488驴抗兔IgG (H+L) | Invitrogen | A-21206 | |
| Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG (H+L) | Invitrogen | A-21202 | |
| Alexa Fluor 488驴抗山羊IgG (H+L) | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗鸡IgY (H+L) | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluo 647驴抗兔IgG (H+L) | Invitrogen | A-31573 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| hESC培养与胚状体形成 | MEF密度、hESC传代方式、培养时长 阅读提示：Step 1，图1A |
| 神经诱导 | NID2处理2天，NID1处理5天，培养基成分（SB431542、CHIR99021、Compound E、Dorsomorphin浓度） 阅读提示：Step 2，图1B-C |
| hNSC传代与鉴定 | 传代密度1×10^5 cells/cm²，Y-27632浓度10μM，P3检测SOX2、PAX6、NESTIN 阅读提示：Step 3，图2C |
| 神经元分化 | hNSC接种密度1.5×10^4 cells/cm²，NDM培养基成分，Laminin浓度20μg/mL及其处理时间，分化时长14天/21天 阅读提示：Step 6-7，图3 |
| 长期培养衰老建模 | 培养天数D7、D21、D35，衰老标志物检测（Lamin B1/B2、SA-β-Gal、Aβ、aggresome） 阅读提示：Step 8，图4 |
| siRNA转染 | siRNA序列（LMNB1、LMNB2、cGAS、NC），转染试剂Lipofectamine 3000用量，转染时间（D0、D6），敲低效率验证时间（48h qRT-PCR、72h免疫荧光） 阅读提示：Step 9，图5 |
| 药物处理 | 药物名称（如阿巴卡韦），处理时间（D21开始至D35，或D12开始至D21），换液时重新添加 阅读提示：Step 11-12，图6 |