猪心脏组织脱细胞与鉴定
制备并验证去除细胞成分、保留ECM结构的心脏脱细胞基质（dECM）。
将1天和4个月大的WT和DMD猪心脏组织切成1毫米薄片，依次用0.3% SDS和3% Triton X-100处理各48小时，然后清洗、冻干。通过DNA含量测定、Masson三色染色和免疫荧光（胶原I、IV，αSARC，cTnT）验证脱细胞效果。
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通过DystroGel模拟肌营养不良心脏细胞外环境
Mimicking the Dystrophic Cardiac Extracellular Environment through DystroGel.
实验完整度
高包含脱细胞、水凝胶表征、蛋白质组学、体外细胞封装及三培养模型等多层级实验，涵盖功能验证和机制验证。
主要模型
猪DMD模型心脏脱细胞基质水凝胶（DystroGel） 人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs） 人诱导多能干细胞来源的交感神经元（iPSC-SNs） 人成纤维细胞
重点核对
使用1天和4个月大的猪心脏组织（WT和DMD）进行脱细胞处理。 DystroGel由4个月大的DMD猪心脏dECM制备，浓度为1%。 将iPSC-CMs（30×10^6 cells/mL）和成纤维细胞（20×10^6 cells/mL）包封在3D构建体中，培养15天。 三培养模型中，iPSC-SNs（2×10^5）在培养1周后接种于构建体表面，再培养7天。 对基因表达分析使用定量RT-PCR，以GAPDH作为内参基因；统计分析使用Student's t检验或重复测量ANOVA。
摘要
摘要：对杜氏肌营养不良症（DMD）等遗传病背后机制的研究进展，凸显了细胞外基质（ECM）组成在疾病进展中的关键作用。有效的体外模型必须复制天然ECM的细胞间关系和理化特性，以完全捕捉疾病特有的特征。尽管最近的生物材料支持体外生物制造病理生理环境，但它们通常缺乏疾病特异性的ECM特征。在本研究中，DystroGel，一种源自猪DMD模型心脏ECM的水凝胶，首次复制了肌营养不良心脏组织的独特分子组成。研究结果表明，肌营养不良ECM基质表现出独特的蛋白质谱，影响对DMD病理学至关重要的细胞过程。这项工作证明了使用3D底物在明确的病理环境中重建细胞间动态的重要性，增强了模拟遗传疾病的能力，并为推进个性化治疗策略提供了有价值的工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在开发一种能够复制杜氏肌营养不良症（DMD）心肌病理微环境的生物材料，并探究其对心肌细胞、成纤维细胞和交感神经元行为的影响。
- 核心机制
- 研究发现DMD心肌ECM中COL5A1和HSPG2等蛋白表达失调，且水凝胶具有更高的刚度和稳定性，模拟了纤维化组织。这些特征通过机械传导影响细胞行为，如成纤维细胞中TGF-β和COL1A1表达上调，iPSC-CMs中NKX2.5和NPPA上调，以及iPSC-SNs神经突生长减少，部分通过p75NTR/TrkA比值变化介导。
- 主要证据
- 通过脱细胞、流变学、压缩测试、SEM、蛋白质组学分析表征DystroGel；体外封装成纤维细胞、iPSC-CMs和iPSC-SNs，通过活/死染色、免疫荧光和RT-qPCR评估细胞活力和基因表达；建立三培养模型模拟神经心脏连接，观察到DystroGel上神经末梢面积减少，并伴有p75NTR上调。
- 研究意义
- DystroGel作为心脏组织工程的先进材料，复制了DMD心肌的分子和生物力学环境，为理解疾病机制和评估靶向治疗提供了临床相关平台，有望弥合临床前研究与临床应用之间的差距。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
dECM水凝胶制备与理化表征
制备可注射的dECM水凝胶，并评估其流变学、力学、稳定性和微观结构特性，以验证其模拟肌营养不良组织的特性。
将冻干dECM溶于醋酸和胃蛋白酶，中和至pH 7.4，形成1%的预凝胶。通过剪切速率和时扫测试评估流变性质，压缩测试测量杨氏模量，30天失重测试评估稳定性，SEM分析孔隙率。
蛋白质组学分析
比较不同年龄和基因型dECM水凝胶的蛋白质组成，鉴定差异表达蛋白和通路。
采用nLC-MS/MS对dECM样本进行蛋白质组学分析，通过标签定量和生物信息学分析（PPI网络、层次聚类）鉴定差异表达蛋白。
DystroGel打印性测试
评估DystroGel作为生物墨水在3D打印中的可用性，以生成结构化的组织工程构建体。
使用RoWS生物打印机进行核壳纤维打印，核心为1% dECM，外壳为2%低分子量海藻酸盐，挤出到氯化钙交联浴中，收集并交联。
细胞包封和活/死分析
验证DystroGel对成纤维细胞、iPSC-CMs和iPSC-SNs的细胞相容性。
将细胞悬浮在dECM水凝胶中，培养15天，使用活/死染色（Calcein AM/ EthD-1）评估细胞活力。
细胞形态和基因表达分析
评估DystroGel对细胞形态、铺展和基因表达的影响，特别是与纤维化、心肌成熟和神经元分化相关基因。
通过共聚焦显微镜观察细胞形态，并用RT-qPCR检测成纤维细胞（TGF-β、α-SMA、HSPG2、COL1A1），iPSC-CMs（NKX2.5、NPPA、NPPB、cTnI）和iPSC-SNs（MAP2、NGF、TRKA、p75NTR）的基因表达。
建立多细胞3D神经心脏连接模型
模拟DMD心脏中交感神经支配受损，评估DystroGel对神经末梢生长和功能整合的影响。
将成纤维细胞和iPSC-CMs共包封在dECM中形成3D构建体，培养1周后，将iPSC-SNs接种于表面，再培养7天，通过免疫荧光和基因表达分析评估神经分布和突触形成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 脱细胞处理 | 十二烷基硫酸钠 | -- | -- |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| dECM水凝胶生成 | 胃蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P7125 |
| DNA定量 | GRS基因组DNA提取试剂盒（组织） | Grisp | GK03.0100 |
| 超微量分光光度计 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 免疫荧光 | 抗肌节α-辅肌动蛋白抗体 | Bioss-Antibodies | bs-10367R |
| 心肌肌钙蛋白T抗体 | Abcam | ab8295 | |
| 胶原I抗体 | Novus Biologicals | NB600-408 | |
| 胶原IV抗体 | Abcam | ab6586 | |
| 流变学测试 | 流变仪 | Anton Paar | -- |
| 形态学分析 | 临界点干燥仪 | Quorum Technologies | -- |
| 溅射镀膜仪 | Safematic | -- | |
| 场发射扫描电子显微镜 | Carl Zeiss AG | -- | |
| 3D生物打印 | 低分子量海藻酸盐 | -- | -- |
| 高分子量海藻酸盐 | -- | -- | |
| 氯化钙 | -- | -- | |
| 蛋白质组学 | RapiGest SF表面活性剂 | Waters Corporation | 186001861 |
| Qubit蛋白质定量试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| Qubit 4荧光计 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 测序级胰蛋白酶 | Promega | V5280 | |
| C18离心柱 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965092 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270106 | |
| 青霉素-链霉素 | Corning | 30-002-CI | |
| iPSC培养 | 玻连蛋白XF | STEMCELL Technologies | 07180 |
| TeSR-E8培养基 | STEMCELL Technologies | 05990 | |
| EDTA | -- | -- | |
| iPSC向心肌细胞分化 | 心肌细胞分化试剂盒 | STEMCELL Technologies | 05010 |
| 温和细胞解离试剂 | STEMCELL Technologies | -- | |
| RevitaCell | GIBCO | A2644501 | |
| Matrigel基质胶 | Corning | -- | |
| iPSC向交感神经元分化 | Geltrex基质胶 | -- | -- |
| mTeSR1培养基 | -- | -- | |
| StemFlex培养基 | -- | -- | |
| N2添加剂 | -- | -- | |
| B-27 plus培养基 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 抗坏血酸 | -- | -- | |
| 双丁酰环磷酸腺苷 | -- | -- | |
| 神经生长因子 | -- | -- | |
| 脑源性神经营养因子 | -- | -- | |
| 胶质细胞源性神经营养因子 | -- | -- | |
| 骨形态发生蛋白4 | -- | -- | |
| 三培养模型 | 神经生长因子 | Sigma-Aldrich | SRP3018 |
| 活/死染色 | 活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒 | Invitrogen | L3224 |
| 免疫荧光 | 波形蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | V5255 |
| β3-微管蛋白抗体 | BioLegend | 802001 | |
| ER-TR7抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-73355 | |
| 基因表达分析 | RNeasy Plus Universal Mini Kit | Qiagen | -- |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| QuantStudio 1实时荧光定量PCR系统 | ThermoFisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 脱细胞处理 | 组织来源（1天和4个月猪，WT/DMD），SDS和Triton X-100浓度及处理时间，dECM洗涤和冻干条件。 阅读提示：见实验部分“Porcine Cardiac Tissue Decellularization” |
| dECM水凝胶制备 | 胃蛋白酶与dECM比例（10 mg/100 mg），醋酸浓度（0.5 M），中和pH（7.4），水凝胶浓度（1%）。 阅读提示：见实验部分“dECM-Based Hydrogel Generation” |
| 细胞包封 | 细胞密度（成纤维细胞20×10^6 cells/mL，iPSC-CMs 30×10^6 cells/mL，iPSC-SNs 2×10^5 cells/构建体），培养时间（15天）。 阅读提示：见实验部分“3D Culture” |
| 三培养模型构建 | 细胞比例，iPSC-SNs接种时间（1周后），共培养时间（7天），NGF浓度（10 ng/mL）。 阅读提示：见实验部分“3D Culture” |
| 基因表达分析 | RNA提取量，逆转录条件，qPCR引物序列（见表1），内参基因（GAPDH），统计数据（n=3）。 阅读提示：见实验部分“Gene Expression Analysis”和“Table 1” |