体外细胞增殖抑制实验
评估TMG对CT26.WT细胞活力的影响。
用CCK-8法检测不同浓度TMG处理24小时后的细胞活力。
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乳酸菌转化主要人参皂苷产生的总稀有皂苷通过诱导凋亡和调节肠道菌群发挥抗结直肠癌作用
Anti-colorectal cancer effect of total minor ginsenosides produced by lactobacilli transformation of major ginsenosides by inducing apoptosis and regulating gut microbiota.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内异种移植模型、16S rRNA肠道菌群测序等多个独立证据层级，并进行了凋亡通路和Raf/MEK/ERK通路的功能验证。
主要模型
小鼠结肠癌细胞系CT26.WT BALB/c小鼠CT26.WT皮下移植瘤模型 肠道菌群测序粪便样本
重点核对
TMG浓度：0、25、50、100、200 μg/mL，处理24小时 体内给药剂量：TMG 100 mg/kg/天，灌胃给药21天 CTX阳性对照剂量：25 mg/kg/天，腹腔注射 细胞系：CT26.WT，来源于武汉赛维尔生物科技有限公司 BALB/c小鼠：雌性，20-22 g，共30只
摘要
目的：以往报道表明稀有皂苷具有很好的抗癌作用。通过植物乳杆菌发酵主要人参皂苷获得总稀有皂苷（TMG），并研究了TMG对小鼠结肠癌细胞CT26.WT在体外和体内的潜在抗癌作用。材料与方法：我们采用CCK-8、TUNEL和Western blot分析在体外探索TMG对CT26.WT细胞的抗增殖和促凋亡功能。在体内，通过皮下注射CT26.WT细胞建立异种移植模型，并对荷瘤小鼠给予100 mg/kg/天的TMG。通过免疫组织化学和Western blot检测肿瘤组织中的凋亡水平和各种蛋白的表达。使用高通量16S rRNA测序确定肠道菌群的变化。结果：体外研究表明TMG显著抑制CT26.WT细胞的增殖并促进其凋亡。有趣的是，TMG通过影响Bax/Bcl-2/caspase-3通路诱导CT26.WT细胞凋亡。此外，移植瘤模型结果显示，TMG显著增强了Bax和caspase-3的活性，降低了Bcl-2的活性，并抑制了Raf/MEK/ERK蛋白水平的表达。粪便分析显示，TMG通过增加有益菌乳杆菌的丰度和减少有害菌变形杆菌的丰度，重塑了结直肠癌小鼠的肠道菌群。结论：TMG可通过多种凋亡机制发挥有效的抗结直肠癌作用，其作用方式与肠道菌群的调节密切相关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TMG是否具有抗结直肠癌作用，及其作用机制是否涉及凋亡和肠道菌群调节。
- 核心机制
- TMG通过调控Bax/Bcl-2/caspase-3通路和抑制Raf/MEK/ERK信号通路诱导凋亡，并通过增加有益菌乳杆菌和减少有害菌变形杆菌调节肠道菌群。
- 主要证据
- 体外实验显示TMG抑制CT26.WT细胞增殖并诱导凋亡，Western blot显示Bax、caspase-3升高，Bcl-2降低；体内实验显示TMG抑制肿瘤生长，IHC和Western blot证实凋亡相关蛋白变化和Raf/MEK/ERK通路抑制，16S rRNA测序显示肠道菌群改变。
- 研究意义
- TMG可能通过调节肠道菌群和影响凋亡通路发挥抗结直肠癌作用，为结直肠癌治疗提供新策略，并提高药物生物利用度。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞凋亡检测
探究TMG是否诱导CT26.WT细胞凋亡。
采用TUNEL染色观察凋亡细胞，并使用ImageJ软件计数。
体外凋亡相关蛋白表达检测
验证TMG对凋亡相关蛋白表达的影响。
利用Western blot检测CT26.WT细胞中Bax、Bcl-2、caspase-3和cleaved-caspase-3的表达水平。
体内异种移植瘤模型建立与给药
评估TMG在体内的抗肿瘤效果。
将CT26.WT细胞接种于BALB/c小鼠右胁皮下建立移植瘤模型，成瘤后分组给药21天，收集肿瘤组织和粪便。
免疫组化检测肿瘤组织凋亡蛋白
检测体内肿瘤组织中凋亡相关蛋白的表达。
采用免疫组化染色观察cleaved-caspase-3、Bax和Bcl-2的表达。
Western blot检测信号通路蛋白
验证TMG对Raf/MEK/ERK通路的影响。
利用Western blot检测肿瘤组织中Raf、p-Raf、MEK、p-MEK、ERK1/2和p-ERK1/2的表达。
肠道菌群16S rRNA测序分析
评估TMG对结直肠癌小鼠肠道菌群的影响。
对小鼠粪便样本进行16S rRNA V3-V4区测序，分析α多样性和β多样性、菌群组成和差异物种。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| TMG制备 | MRS肉汤 | -- | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | US Everbright Inc. | -- |
| 细胞凋亡检测 | TUNEL试剂盒 | Wuhan Service Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
| 免疫组化 | DAB显色液 | -- | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 抗β-actin抗体 | GeneTex | GTX629630 | |
| 抗Raf抗体 | CST | #9422 | |
| 抗p-Raf抗体 | CST | #9421 | |
| 抗MEK抗体 | Bioss | bs-1433R | |
| 抗p-MEK抗体 | Bioss | bs-3270R | |
| 抗ERK1/2抗体 | GeneTex | GTX134462 | |
| 抗p-ERK1/2抗体 | GeneTex | GTX24819 | |
| 抗Bcl-2抗体 | Bioss | bs-4563R | |
| 抗caspase-3抗体 | CST | #9661 | |
| 抗cleaved-caspase-3抗体 | CST | #9661 | |
| 抗Bax抗体 | Proteintech | 50599-2-Ig | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 免疫组化 | 抗cleaved-caspase-3抗体 | Servicebio | GB11532 |
| 抗Bcl-2抗体 | Servicebio | GB113375 | |
| 抗Bax抗体 | Servicebio | GB114122 | |
| 细胞培养 | CT26.WT细胞 | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | -- |
| 动物实验 | BALB/c小鼠 | Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| TMG制备 | 植物乳杆菌MB11 | -- | -- |
| D101大孔树脂 | -- | -- | |
| TMG成分分析 | 高效液相色谱 | -- | -- |
| 液相色谱-质谱联用 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | SpectraMax ABS Plus酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | -- | -- |
| Western blot成像 | Image Quant LAS 4000成像系统 | Fuji Film | -- |
| 免疫组化 | 尼康ECLIPSE E100显微镜 | Nikon | -- |
| 肠道菌群测序 | Illumina MiSeq平台 | Sangon Biotech Co., Ltd. | -- |
| 统计分析 | SPSS Statistics 20版 | -- | -- |
| Origin 8.0 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞增殖实验 | 细胞系CT26.WT来源，培养条件（RPMI-1640加10% FBS），细胞密度，TMG浓度，处理时间 阅读提示：见Materials and Methods 2.2和2.3，Figure 1图注 |
| 体外凋亡检测 | TMG浓度200 μg/mL，CTX浓度100 μg/mL，处理时间24小时，TUNEL试剂盒来源 阅读提示：见Materials and Methods 2.4，Figure 2图注 |
| 体内异种移植模型 | BALB/c小鼠品系、性别、体重，CT26.WT细胞接种数量，给药剂量（TMG 100 mg/kg/天，CTX 25 mg/kg/天）和方式，给药持续时间 阅读提示：见Materials and Methods 2.5 |
| 蛋白表达检测 | 抗体品牌和货号，蛋白上样量，一抗稀释比例，二抗来源 阅读提示：见Materials and Methods 2.6 |
| 肠道菌群分析 | 粪便样本采集时间，DNA提取方法，16S rRNA V3-V4区域引物，测序平台，生物信息学分析方法 阅读提示：见Materials and Methods 2.8 |