构建MCI预后模型
基于bulk RNA-seq数据量化微环境细胞浸润并构建预后预测模型
使用xCell算法计算64种免疫和基质细胞比例，采用LASSO-Cox回归筛选六种MCs并计算MCI。
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微环境细胞指数是癌症预后和治疗方案选择的新型指标
The microenvironment cell index is a novel indicator for the prognosis and therapeutic regimen selection of cancers.
实验完整度
高包含多层级验证：bulk RNA-seq建模、scRNA-seq/SRT/mIF验证、动物模型功能验证及机制研究。
主要模型
TNBC患者队列（allTNBC、trainTNBC、testTNBC1、testTNBC2） TNBC组织微阵列（mIF队列，n=65） MDA-MB-231细胞系（CCLE） MDA-MB-231异种移植瘤小鼠模型（NOD-SCID小鼠）
重点核对
MCI模型构建基于LASSO-Cox回归，需验证六个细胞类型的系数和最优log λ 使用scRNA-seq、SRT、mIF验证六种MCs的存在和比例 MCI-e模型需验证空间特征参数（如细胞数、比例、距离、TLS面积） HNMPA给药剂量和方案（每周两次，共1周） 动物分组（NC、DOX、HNMPA、Combination）和样本量（NC=13, DOX=13, HNMPA=15, Combination=15）
摘要
背景：基于微环境细胞（MCs）浸润建立预后预测模型并探索三阴性乳腺癌（TNBC）的新治疗策略是有价值的。方法：使用xCell算法基于批量RNA测序（bulk RNA-seq）数据量化TNBC微环境的细胞组分。采用最小绝对收缩和选择算子Cox（LASSO-Cox）回归分析构建MCs指数（MCI）。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间分辨转录组学（SRT）和多重免疫荧光（mIF）染色分析验证MCI。在荷瘤小鼠中研究MCI的作用机制。结果：MCI由六种MCs组成，可精确预测TNBC患者的预后。scRNA-seq、SRT和mIF分析验证了这些细胞的存在和比例。此外，结合六种MCs的空间分布特征，构建了MCI增强（MCI-e）模型，能更准确地预测TNBC患者的预后。更重要的是，抑制MCI高表达TNBC患者癌细胞中激活的胰岛素信号通路，显著延长了荷瘤小鼠的生存时间。结论：总的来说，我们的结果表明MCs浸润可作为TNBC患者预后和治疗方案选择的新型指标。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 基于微环境细胞浸润的预后预测模型能否准确预测TNBC患者预后并指导治疗方案选择？
- 核心机制
- MCI高表达的TNBC患者癌细胞中胰岛素信号通路显著激活，抑制该通路可延长荷瘤小鼠生存时间，并诱导淋巴细胞浸润。
- 主要证据
- 通过bulk RNA-seq构建MCI，scRNA-seq、SRT、mIF验证细胞存在和比例；动物实验显示HNMPA抑制肿瘤生长并延长生存期。
- 研究意义
- MCs浸润指数可作为TNBC预后预测和治疗方案选择的新型指标，靶向胰岛素通路可能成为治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证MCI预测性能
验证MCI在多个队列中的预后预测能力
通过KM分析、时间依赖性ROC曲线评估MCI对OS、3年、10年生存的预测准确性。
验证六种MCs的存在和比例
验证MCI中六种MCs在TNBC组织中的真实存在和比例
利用scRNA-seq、SRT和mIF染色分析，结合余弦相似性评估比例一致性。
构建MCI-e模型
结合空间分布特征构建增强模型以提升预测准确性
基于mIF定量分析提取53个空间特征，采用LASSO-Cox回归构建MCI-e1、MCI-e2、MCI-e3模型。
机制探索：胰岛素信号通路
探究MCI高表达患者肿瘤细胞中激活的信号通路并提出治疗靶点
通过KEGG富集分析、贝叶斯网络分析、CCLE细胞系数据验证胰岛素通路激活，并用HNMPA在动物模型中验证疗效。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
构建预后模型
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体面板1（mIF） | CD38抗体 | Abcam | ab108403 |
| CD34抗体 | Abcam | ab81289 | |
| CD45RA抗体 | Abcam | ab755 | |
| CD27抗体 | Abcam | ab131254 | |
| CD19抗体 | Abcam | ab134114 | |
| 抗体面板2（mIF） | CD3抗体 | Abcam | ab16669 |
| IL4抗体 | Abcam | ab239508 | |
| CD64抗体 | Abcam | ab140779 | |
| CD11c抗体 | CST | 4581 | |
| CD4抗体 | Abcam | ab133616 | |
| CD8抗体 | Abcam | ab101500 | |
| mIF染色 | Opal 7色试剂盒 | PerkinElmer | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| HE染色 | 伊红 | -- | -- |
| 二甲苯 | -- | -- | |
| 乙醇 | -- | -- | |
| 盐酸 | -- | -- | |
| mIF定量分析 | TissueFAXS平台 | -- | -- |
| StrataQuest软件 | -- | -- | |
| 抗体孵育 | 抗体稀释液 | -- | -- |
| 辣根过氧化物酶 | -- | -- | |
| 细胞培养 | HMEL细胞系 | -- | CVCL_IZ34 |
| 动物实验 | HNMPA | Target MOI | 159969 |
| 阿霉素 | Shenzhen Main Luck Pharmaceuticals, Inc. | 2204E3 | |
| 吐温-80 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 抗Ki67抗体 | CST | 12202 |
| Envision系统 | Dako | K3468 | |
| 免疫荧光 | p-AKT抗体 | BIOSS | BS-0876R |
| p-ERK抗体 | BIOSS | BS-2637R | |
| 抗CD45抗体 | Biolegend | 109837 | |
| 组织切片 | KF-PRO-120数字切片扫描仪 | KFBIO | -- |
| 中性树胶 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据预处理 | 批量效应去除方法（removeBatchEffect）、数据集合并条件 阅读提示：Methods: Preprocessing of the bluk RNA-seq cohorts |
| MCI模型构建 | LASSO-Cox回归参数（最优log λ）、六种MCs的系数 阅读提示：Methods: Constitution of the MCI; Results: 图1b、c |
| scRNA-seq分析 | 整合方法（Harmony）、聚类参数 阅读提示：Methods: Analysis of the TNBC scRNA-seq cohort |
| SRT分析 | 质量控制标准、主成分数（30）、可视化算法 阅读提示：Methods: Analysis of the TNBC SRT cohort |
| mIF染色 | 抗体克隆号、稀释度、抗原修复条件、染色循环次数 阅读提示：Methods: mIF staining [30–32] |
| mIF定量分析 | 阈值设置、细胞分割方法、ROI划分 阅读提示：Methods: mIF quantitative analysis (phase I-III) |
| 动物实验 | HNMPA和DOX的给药剂量、频率、途径、动物周龄和品系 阅读提示：Methods: Animal model and dosage regimen; 图8a |