PEDV感染IPEC-J2细胞模型建立
验证PEDV能否有效感染IPEC-J2细胞并诱导IL-1β产生。
用PEDV CV777株以不同MOI和时间感染IPEC-J2细胞,检测PEDV N蛋白表达、IL-1β mRNA和分泌水平。
Porcine Epidemic Diarrhea Virus Infection of Porcine Intestinal Epithelial Cells Causes Mitochondrial DNA Release and the Activation of the NLRP3 Inflammasome to Mediate Interleukin-1β Secretion.
涵盖体外细胞感染模型、基因沉默、药理学抑制剂、免疫共沉淀、线粒体功能检测和机制验证。
猪肠道上皮细胞系IPEC-J2 PEDV CV777株
PEDV感染IPEC-J2细胞的MOI和时间 NLRP3 siRNA敲低效率 MCC950、Mito-TEMPO、BAY11-7082等抑制剂的浓度和处理时间 DNase I蛋白转染效率
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PEDV能否有效感染IPEC-J2细胞并诱导IL-1β产生。
用PEDV CV777株以不同MOI和时间感染IPEC-J2细胞,检测PEDV N蛋白表达、IL-1β mRNA和分泌水平。
探究IL-1β分泌是否依赖于caspase-1活性。
检测PEDV感染后caspase-1酶活性及caspase-1 P20蛋白表达;使用Ac-YVAD-cmk抑制caspase-1后检测IL-1β分泌。
确定PEDV感染是否激活NLRP3炎症小体。
检测NLRP3和ASC mRNA表达;免疫共沉淀验证NLRP3与ASC和pro-caspase-1的相互作用。
验证NLRP3炎症小体是否介导IL-1β分泌。
使用MCC950抑制NLRP3或siRNA敲低NLRP3表达,检测IL-1β分泌和炎症小体蛋白表达。
评估PEDV感染对线粒体功能的影响以及mtDNA是否释放。
检测线粒体膜电位、ATP水平、mtROS产生;免疫荧光观察mtDNA与线粒体的共定位。
探究mtROS是否激活NF-κB信号通路进而促进IL-1β转录。
检测NF-κB p65和pp65表达;使用BAY11-7082抑制NF-κB或Mito-TEMPO抑制mtROS,检测IL-1β表达和分泌。
验证释放的mtDNA是否激活NLRP3炎症小体。
使用DNase I转染消化mtDNA,检测NLRP3炎症小体表达、caspase-1活性和IL-1β分泌。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM F12培养基 | HyClone | SH30271.FS |
| 胎牛血清 | BI | 04-001-1ACS | |
| 胰蛋白酶 | HyClone | SH30042.01 | |
| RNA提取 | 总RNA提取试剂盒 | Bioer | BSC60S1 |
| qPCR | qPCR引物 | 上海生工生物工程股份有限公司 | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000001 |
| siRNA双链体 | 赛索飞生物科技(无锡)有限公司 | -- | |
| ELISA | 猪IL-1β ELISA试剂盒 | 酶联生物科技(上海)有限公司 | MB-2562A |
| Caspase-1活性检测 | caspase-1活性检测试剂盒 | Beyotime | C1102 |
| Western blot | 裂解液 | Yazyme | PC101 |
| BCA试剂盒 | Thermo | A55860 | |
| 快速封闭液 | Yazyme | PS108P | |
| HRP标记的抗兔二抗 | Affinity | S0001 | |
| 化学发光成像系统 | Bio-Rad | GS-800 | |
| 小鼠单克隆PEDV N抗体 | Biogradetech | BGT-ANT-37707 | |
| 兔多克隆抗IL-1β抗体 | Bioss | bs-0812R | |
| 兔单克隆ASC抗体 | Wanleibio | WL02462 | |
| 兔单克隆NLRP3抗体 | Wanleibio | WL02635 | |
| 兔单克隆IL-1β P17抗体 | Wanleibio | WL00891 | |
| 兔多克隆caspase-1抗体 | Proteintech | 22915-1-AP | |
| 兔单克隆NF-κB p65抗体 | Affinity | AF5006 | |
| NF-κB pp65抗体 | Affinity | AF2006 | |
| 兔单克隆GAPDH抗体 | Servicebio | GB15004-100 | |
| 免疫沉淀 | 脂多糖 | Sigma | L2630 |
| 三磷酸腺苷 | MCE | HY-B2176 | |
| Protein A/G免疫沉淀试剂盒 | Yazyme | YJ201 | |
| 抑制剂处理 | Mito-TEMPO | MCE | HY-112879 |
| Ac-YVAD-cmk | MCE | HY-16990 | |
| BAY11-7082 | MCE | HY-13453 | |
| MCC950 | MCE | HY-12815 | |
| 线粒体功能检测 | JC-1染料 | Beyotime | C2006 |
| 荧光显微镜 | Olympus | BX53 | |
| 增强型ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0027 | |
| MitoSOX Red线粒体超氧化物探针 | Yeasen | 40778ES50 | |
| mtDNA定位 | Mito-Tracker Red CMXRos | Beyotime | C1049B |
| Picogreen染料 | Yeasen | 12641ES01 | |
| DNase I转染 | 脱氧核糖核酸酶I | MCE | HY-108882 |
| Starvio转染试剂 | EMI Biotechnology | T81001 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞感染与培养 | PEDV MOI和感染时间;培养条件和培养基 阅读提示:Materials and Methods: Cell Lines and Virus Strains (Section 2.1) |
| siRNA转染 | siRNA序列和转染试剂;转染时间和浓度 阅读提示:Materials and Methods: siRNA (Section 2.3) |
| 抑制剂处理 | 抑制剂种类、浓度和处理时间 阅读提示:Materials and Methods: Inhibitor Treatment (Section 2.8) |
| qPCR | 引物序列和基因;RNA提取和反转录方法 阅读提示:Materials and Methods: Quantitative PCR (Section 2.2),表1 |
| Western blot | 抗体及其稀释比例;蛋白上样量和膜处理 阅读提示:Materials and Methods: Western Blot Analysis (Section 2.6) |
| 免疫共沉淀 | 抗体量和孵育时间;磁珠类型和洗涤条件 阅读提示:Materials and Methods: Immunoprecipitation Assay (Section 2.7) |
| 线粒体功能检测 | JC-1、ATP检测试剂盒和MitoSOX探针的使用方法 阅读提示:Materials and Methods: Detection of Mitochondrial Membrane Potential, ATP, and mtROS (Section 2.9) |
| mtDNA释放检测 | Mito-Tracker和Picogreen染色方法 阅读提示:Materials and Methods: mtDNA Localization (Section 2.10) |
| DNase I处理 | DNase I浓度和转染时间 阅读提示:Materials and Methods: DNase I Protein Transfection (Section 2.11) |