猪流行性腹泻病毒感染猪肠道上皮细胞导致线粒体DNA释放和NLRP3炎症小体激活,介导白细胞介素-1β分泌

Porcine Epidemic Diarrhea Virus Infection of Porcine Intestinal Epithelial Cells Causes Mitochondrial DNA Release and the Activation of the NLRP3 Inflammasome to Mediate Interleukin-1β Secretion.

作者信息Di Bao, Shushuai Yi, Luobing Zhao, Han Zhao, Jiuyuan Liu, Yiming Wei, Guixue Hu, Xinxin Liu
PMID39728983
期刊Vet Sci
发布时间2024-12-12
DOI10.3390/vetsci11120643

实验完整度

涵盖体外细胞感染模型、基因沉默、药理学抑制剂、免疫共沉淀、线粒体功能检测和机制验证。

主要模型

猪肠道上皮细胞系IPEC-J2 PEDV CV777株

重点核对

PEDV感染IPEC-J2细胞的MOI和时间 NLRP3 siRNA敲低效率 MCC950、Mito-TEMPO、BAY11-7082等抑制剂的浓度和处理时间 DNase I蛋白转染效率

摘要

猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起仔猪肠炎和腹泻。线粒体DNA(mtDNA)参与病毒诱导的炎症反应;然而,炎症小体在PEDV感染反应中的作用仍不清楚。我们研究了PEDV感染猪肠道上皮(IPEC-J2)细胞期间炎症小体介导的白细胞介素(IL)-1β分泌的机制。通过定量PCR和酶联免疫吸附试验评估IL-1β的产生和caspase-1活性。通过免疫沉淀实验评估NLRP3炎症小体激活。通过分析线粒体膜电位和ATP水平以及通过流式细胞术检查线粒体活性氧(mtROS)来评估线粒体损伤。线粒体和mtDNA定位通过免疫荧光观察。抑制mtROS和mtDNA的产生使NLRP3炎症小体和IL-1β表达的检测以及PEDV感染的IPEC-J2细胞中NLRP3炎症小体激活通路的评估成为可能。IPEC-J2细胞在PEDV感染时上调IL-1β,其中成熟IL-1β的分泌依赖于caspase-1活性,触发NLRP3炎症小体表达和组装,并导致线粒体功能障碍,导致mtDNA释放和NLRP3炎症小体激活,而mtROS有助于NF-κB通路激活,增强IL-1β分泌。这是首次证明mtDNA释放和NLRP3炎症小体激活促进PEDV感染的IPEC-J2细胞分泌IL-1β的机制。这些数据增强了我们对PEDV触发的炎症机制的理解。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
PEDV感染猪肠道上皮细胞后,炎症小体是否介导IL-1β分泌,以及其潜在分子机制。
核心机制
PEDV感染导致线粒体功能障碍和mtROS产生,进而激活NF-κB信号通路;同时,mtDNA释放到细胞质中激活NLRP3炎症小体,通过caspase-1裂解pro-IL-1β,促进成熟IL-1β分泌。
主要证据
在IPEC-J2细胞中,PEDV感染诱导IL-1β表达和分泌;caspase-1抑制剂减少IL-1β分泌;免疫共沉淀显示NLRP3与ASC和pro-caspase-1结合;线粒体膜电位降低、ATP减少、mtROS增加和mtDNA释放;抑制mtROS或mtDNA减少IL-1β分泌。
研究意义
首次揭示PEDV通过mtDNA释放激活NLRP3炎症小体介导IL-1β分泌的机制,为开发抗PEDV靶向药物提供新思路。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

PEDV感染IPEC-J2细胞模型建立

验证PEDV能否有效感染IPEC-J2细胞并诱导IL-1β产生。

用PEDV CV777株以不同MOI和时间感染IPEC-J2细胞,检测PEDV N蛋白表达、IL-1β mRNA和分泌水平。

2

caspase-1活性检测

探究IL-1β分泌是否依赖于caspase-1活性。

检测PEDV感染后caspase-1酶活性及caspase-1 P20蛋白表达;使用Ac-YVAD-cmk抑制caspase-1后检测IL-1β分泌。

3

NLRP3炎症小体激活验证

确定PEDV感染是否激活NLRP3炎症小体。

检测NLRP3和ASC mRNA表达;免疫共沉淀验证NLRP3与ASC和pro-caspase-1的相互作用。

4

NLRP3炎症小体功能验证

验证NLRP3炎症小体是否介导IL-1β分泌。

使用MCC950抑制NLRP3或siRNA敲低NLRP3表达,检测IL-1β分泌和炎症小体蛋白表达。

5

线粒体功能障碍和mtDNA释放检测

评估PEDV感染对线粒体功能的影响以及mtDNA是否释放。

检测线粒体膜电位、ATP水平、mtROS产生;免疫荧光观察mtDNA与线粒体的共定位。

6

mtROS对NF-κB通路的激活

探究mtROS是否激活NF-κB信号通路进而促进IL-1β转录。

检测NF-κB p65和pp65表达;使用BAY11-7082抑制NF-κB或Mito-TEMPO抑制mtROS,检测IL-1β表达和分泌。

7

mtDNA对NLRP3炎症小体的激活

验证释放的mtDNA是否激活NLRP3炎症小体。

使用DNase I转染消化mtDNA,检测NLRP3炎症小体表达、caspase-1活性和IL-1β分泌。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM F12培养基HyCloneSH30271.FS
胎牛血清BI04-001-1ACS
胰蛋白酶HyCloneSH30042.01
总RNA提取试剂盒BioerBSC60S1
qPCR引物上海生工生物工程股份有限公司--
Lipofectamine 3000转染试剂InvitrogenL3000001
siRNA双链体赛索飞生物科技(无锡)有限公司--
猪IL-1β ELISA试剂盒酶联生物科技(上海)有限公司MB-2562A
caspase-1活性检测试剂盒BeyotimeC1102
裂解液YazymePC101
BCA试剂盒ThermoA55860
快速封闭液YazymePS108P
HRP标记的抗兔二抗AffinityS0001
化学发光成像系统Bio-RadGS-800
小鼠单克隆PEDV N抗体BiogradetechBGT-ANT-37707
兔多克隆抗IL-1β抗体Biossbs-0812R
兔单克隆ASC抗体WanleibioWL02462
兔单克隆NLRP3抗体WanleibioWL02635
兔单克隆IL-1β P17抗体WanleibioWL00891
兔多克隆caspase-1抗体Proteintech22915-1-AP
兔单克隆NF-κB p65抗体AffinityAF5006
NF-κB pp65抗体AffinityAF2006
兔单克隆GAPDH抗体ServicebioGB15004-100
脂多糖SigmaL2630
三磷酸腺苷MCEHY-B2176
Protein A/G免疫沉淀试剂盒YazymeYJ201
Mito-TEMPOMCEHY-112879
Ac-YVAD-cmkMCEHY-16990
BAY11-7082MCEHY-13453
MCC950MCEHY-12815
JC-1染料BeyotimeC2006
荧光显微镜OlympusBX53
增强型ATP检测试剂盒BeyotimeS0027
MitoSOX Red线粒体超氧化物探针Yeasen40778ES50
Mito-Tracker Red CMXRosBeyotimeC1049B
Picogreen染料Yeasen12641ES01
脱氧核糖核酸酶IMCEHY-108882
Starvio转染试剂EMI BiotechnologyT81001

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞感染与培养
PEDV MOI和感染时间;培养条件和培养基
阅读提示:Materials and Methods: Cell Lines and Virus Strains (Section 2.1)
siRNA转染
siRNA序列和转染试剂;转染时间和浓度
阅读提示:Materials and Methods: siRNA (Section 2.3)
抑制剂处理
抑制剂种类、浓度和处理时间
阅读提示:Materials and Methods: Inhibitor Treatment (Section 2.8)
qPCR
引物序列和基因;RNA提取和反转录方法
阅读提示:Materials and Methods: Quantitative PCR (Section 2.2),表1
Western blot
抗体及其稀释比例;蛋白上样量和膜处理
阅读提示:Materials and Methods: Western Blot Analysis (Section 2.6)
免疫共沉淀
抗体量和孵育时间;磁珠类型和洗涤条件
阅读提示:Materials and Methods: Immunoprecipitation Assay (Section 2.7)
线粒体功能检测
JC-1、ATP检测试剂盒和MitoSOX探针的使用方法
阅读提示:Materials and Methods: Detection of Mitochondrial Membrane Potential, ATP, and mtROS (Section 2.9)
mtDNA释放检测
Mito-Tracker和Picogreen染色方法
阅读提示:Materials and Methods: mtDNA Localization (Section 2.10)
DNase I处理
DNase I浓度和转染时间
阅读提示:Materials and Methods: DNase I Protein Transfection (Section 2.11)